青蒿琥酯干预大鼠胶原诱导性关节炎中Foxp3的表达*

洪学志，刘　佳，庄辰晨，林　东，朱梦雅，莫汉有

(桂林医学院附属医院风湿免疫科，广西桂林 541001)



·论著·

青蒿琥酯干预大鼠胶原诱导性关节炎中Foxp3的表达*

洪学志，刘佳，庄辰晨，林东，朱梦雅，莫汉有△

(桂林医学院附属医院风湿免疫科，广西桂林 541001)

目的研究青蒿琥酯干预下表达Foxp3的调节性T细胞在大鼠胶原诱导性关节炎(CIA)脾淋巴细胞及滑膜中表达及意义。方法建立大鼠CIA模型，分为对照组、CIA模型组、CIA模型+不同浓度青蒿琥酯组、CIA模型+甲氨蝶呤(MTX)组、CIA模型+硫酸羟氯喹组、CIA模型+甲基泼尼松龙组。流式检测脾淋巴细胞中Foxp3表达，免疫组化检测Foxp3在大鼠踝关节滑膜细胞中表达。结果CIA模型+20 mg·kg-1·d-1青蒿琥酯组中Foxp3在脾淋巴细胞及滑膜组织中的表达明显高于其他浓度青蒿琥酯组、CIA模型+硫酸羟氯喹组(P<0.05)，与CIA模型+甲基泼尼松龙组在脾淋巴细胞表达中有差异(P<0.05)，与CIA模型+甲氨蝶呤组无差异(P>0.05)。结论青蒿琥酯可上调T淋巴细胞及滑膜中Foxp3的表达，且与剂量呈正相关，当剂量在20 mg·kg-1·d-1时效果最明显。

关节炎，实验性；关节炎，类风湿；Foxp3;青蒿琥酯

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、对称性、持续性致残率极高的一种全身反应性自身免疫性疾病,其病变特点是血管翳形成、自身抗体产生以及骨与软骨的损伤，常伴有心血管、肺、心理等系统性症状[1]。在骨侵蚀破坏过程中新生血管形成与细胞外基质降解是其两个至关重要的环节。目前临床中以中和炎性因子及减少炎性因子的释放取得了很好的疗效。CD4+调节性T细胞在抑制自身抗原应答以及维持免疫平衡和免疫耐受方面起到关键的作用[2]。在动物模型与人类中，调节性T细胞的突变与缺失都会引起自身免疫性疾病的发生，证实调节性T细胞在维持外周免疫耐受以及保持免疫平衡中起到重要作用。Foxp3是CD4+调节性T淋巴细胞的特异性标志[3]，在调控CD4+调节T细胞的发育、表达及功能中发挥了决定性作用[4-5]。目前大量试验证实青蒿琥酯为一种低毒、高效的潜在免疫抑制剂[6]，先前研究表明，青蒿琥酯不仅能通过对NF-κB通路的调节抑制脂多糖(LPS)对滑膜细胞的刺激，减少肿瘤坏死因子(TNF)-α的释放[7-8]，还可抑制白细胞介素(IL)-17、TNF-α的分泌，最终两者的协同作用使滑膜细胞分泌炎症因子减少，从而减少血管翳的形成及骨与软骨的侵蚀[9-10]。本课题拟从T淋巴细胞转录因子角度探讨青蒿琥酯是否通过上调翼状螺旋/叉头转录因子(Foxp3)而起免疫调节作用；明确青蒿琥酯确切治疗靶位，为以后临床实际中应用青蒿琥酯治疗RA提供坚实的理论依据。

1　材料与方法

1.1实验动物SD大鼠，雄性，70只，体质量100 g左右，鼠龄4周。桂林医学院实验动物中心提供。

1.2主要试剂天然牛Ⅱ型胶原：Chondrex公司(美国)，每瓶5 mL；弗氏完全佐剂(complete Freund`s adjuvant，IFA)：Sigma公司(美国)，每瓶10 mL；淋巴细胞激活剂，含高尔基体阻断剂(BD):BD Pharmingen公司(美国)；抗大鼠Foxp3抗体(PE),抗大鼠CD4抗体(APC),大鼠IgG2a 同型对照(PE),Foxp3转录因子染色缓冲液:eBioscience(美国);青蒿琥酯 桂林南药股份有限公司；甲氨蝶呤 (methotrexate，MTX) ，每片2.5 mg，上海信谊制药厂；甲基泼尼松龙 (Prednisone，Pred) ，每支20 mg，湖北远成药业有限公司；硫酸羟氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)，每片0.1 g，上海中西制药有限公司。Anti-Foxp3 抗体(Abcom公司，美国)。

1.3方法

1.3.1CIA动物模型的制备实验前在冰上将牛Ⅱ型胶原缓慢滴加至等体积的弗氏完全佐剂(CFA)中并用注射器充分乳化，使得胶原终浓度为1 mg/mL。将制备好的胶原和佐剂混合物置于冰上保存备用。初次免疫：戊巴比妥钠(0.1 mL/100 g)麻醉大鼠，并将尾根部鼠毛用手术刀刮除，CIA模型组大鼠给予0.2 mL的胶原乳化液尾根部皮内注射，对照组健康大鼠尾根部给予等量的生理盐水皮内注射；加强免疫：于第7天给予模型组对侧尾根部加强免疫0.1 mL的乳化液，对照组给予对侧尾根部等量的生理盐水。最终采用AI评分[11]6分以上的动物模型来进行实验，有56只造模成功。

1.3.2实验分组将关节炎评分达到6分以上的CIA模型大鼠随机分为7组(每组8只)并与健康对照大鼠(9只)共分为8组，分别给予不同的药物观察。具体如下：健康大鼠对照组(A组)；CIA模型对照组(B组)；CIA模型+青蒿琥酯(5 mg·kg-1·d-1)为C组；CIA模型+青蒿琥酯(10 mg·kg-1·d-1) 为D组； CIA模型+青蒿琥酯(20 mg·kg-1·d-1) 为E组；CIA模型+硫酸羟氯喹(40 mg·kg-1·d-1)为F组；CIA模型+甲氨蝶呤(每周2.7 mg/kg) 为G组；CIA模型+甲基泼尼松龙 (5 mg·kg-1·d-1) 为H组。

根据先前的研究[12]，设初次免疫为第0天,灌胃给药开始于初次免疫后第14天,灌胃过程持续18周，到大鼠全部处死历时20周，3周为1个疗程。青蒿琥酯、甲氨蝶呤、硫酸羟氯喹、甲基泼尼松龙采用灌胃给药法，A、B组分别予等量蒸馏水灌胃及等量生理盐水注射。

1.3.3流式细胞术具体步骤取2管细胞，分别加入0.5 μL淋巴细胞激活剂。混匀后，37 ℃，5% CO2培养箱中孵育6 h。加入1 mL流式缓冲液(FACS buffer),离心1 500 r/min，5 min，弃上清液。细胞表面染色： 将细胞用200 μL FACS buffer进行重悬，重悬后于各染色管中加入CD4-APC表面染色试剂5 μL，混匀后于室温暗处孵育30 min。固定与破膜：分别加入1 mL Foxp3/Transcription Factor，在4 ℃暗处条件下孵育40 min。细胞内染色：每管加入100 μL破膜剂buffer，而后在胞内染色管中分别加入5 μL大鼠IgG2a 同型对照(PE)和5 μL Foxp3-PE荧光抗体，充分混匀后于4 ℃暗处孵育30 min。取出后加入1 mL破膜剂buffer，1 500 r/min离心5 min，弃上清液；将细胞重悬于200 μL FACS buffer中，上机分析。流式细胞术结果分析：用CD4设门，选定CD4+T淋巴细胞；绘制散点图，在此基础上确定CD4+foxp3+调节T细胞百分比。然后利用上诉的统计方法进行分析。

1.3.4免疫组化检测步骤踝关节取材：腹腔注射适量的水合氯醛，然后采用脱颈椎脱臼法处死大鼠，截取右下肢，切除脂肪等软组织后，切取后肢胫骨下端、腓骨下端并分离踝关节，用PBS冲洗后浸泡于PBS中。留取踝关节常规脱钙、石蜡包埋。按照试剂说明书步骤检测大鼠踝关节滑膜组织Foxp3水平。

2　结　果

2.1CIA大鼠的临床表现本研究采用尾根部皮内注射的方法免疫大鼠，初次免疫后9～21 d，有56只造模成功(56/61)。初次免疫9 d后开始出现关节炎症，表现为足小趾或踝关节出现红肿(图1)，部分大鼠后腿不能爬行或出现肘关节红肿。在免疫后第42天左右CIA模型组关节炎指数达到高峰以后逐渐转为慢性期。初次免疫后第10周，C组关节炎指数在9.0分左右，D组关节炎指数在7.0分左右，E组关节炎指数在5.0分左右，H关节炎指数在3.0分左右，G组关节炎指数在5.0分左右,F组关节炎指数在7.5分左右,B组关节炎指数在10.5分左右。初次免疫后第21周，C组关节炎指数在7.0分左右，D组关节炎指数在5.0分左右，E组关节炎指数在3.0分左右，H组关节炎指数在3.0分左右，G组关节炎指数在5.0分左右,F组关节炎指数在7.5分左右,B组关节炎指数在11.0～14.0分左右，由此可见E组在改善关节症状方面疗效显著。

A:A组大鼠;B:B组大鼠。

图1大鼠踝关节的比较

2.2脾淋巴细胞表达Foxp3 流式细胞学检测A～H组Foxp3表达百分比(%)分别为1.171±0.191、0.529±0.138、0.729±0.095、2.342±0.217、3.471±0.123、2.371±0.162、3.771±0.109、4.014±0.271。与A组比较，Foxp3在B组中表达降低(P<0.05);在C、D、E各组比较中发现Foxp3表达呈剂量依赖性增长，E组中Foxp3表达最高，且组间差异有统计学意义(P<0.05)；其中D组与F组间差异无统计学意义(P>0.05),但E组与F组间差异有统计学意义(P<0.05)；G组与E组比较差异有统计学意义(P>0.05)；H组中Foxp3表达量最高，与E组、G组比较差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞学检测CD4 T淋巴细胞中 Foxp3 的表达见图2。

2.3免疫组织化学法检测大鼠踝关节滑膜组织中IL-17/Foxp3的表达免疫组织化学分析结果显示，Foxp3除了表达于滑膜细胞层及血管周围外，在软骨表面也有表达，其主要定位于细胞核及胞浆中，为棕褐色颗粒。A～H组Foxp3值分别为：0.048 7±0.008 6、0.018 4±0.004 3、0.037 9±0.009 6、0.043 4±0.004 2、 0.061 7±0.007 2、0.034 3 ±0.008 4、0.054 3±0.008 2、0.065 9±0.008 2，方差分析显示B组Foxp3表达明显低于其他组(P<0.05)，E组Foxp3表达与G组、C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠关节滑膜Foxp3免疫组化染色见图3。

A:Foxp3同型对照;B:A组;C:B组;D:C组;E:D组;F:E组;G:F组；H:G组；I:H组。

图2流式细胞学检测CD4 T淋巴细胞中 Foxp3 的表达

A:A组； B:B组； C:C组； D:D组； E:E组； F:F组； G:G组； H:H组。

图3各组大鼠关节滑膜Foxp3免疫组化染色(×200)

3　讨　论

RA是以小关节病变为主要临床表现可以累及全身的系统性自身免疫性疾病。RA的病因、发病机制尚未明确阐明，目前CIA模型是研究RA常用的最经典动物模型[13]。青蒿素及其衍生物被临床认为是治疗恶性和氯喹抵抗的疟疾最有效和安全的药物。青蒿琥酯是青蒿素的一种半合成衍生物。最近研究提示,青蒿素及其衍生物可能还具有抗炎和免疫调节作用。前期研究发现，青蒿琥酯除调节NF-κB 信号途径抑制LPS 诱导的RA 滑膜细胞分泌TNF-α外，其尚可下调IL-17的活性而发挥作用[14]。本文拟从T淋巴细胞转录因子角度探讨其是否通过上调转录因子 Foxp3的表达进而发挥其免疫调节作用。

本文采用体外培养不同药物干预的CIA大鼠滑膜细胞及体内CD4 T淋巴细胞研究发现,青蒿琥酯能明显抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的增生，并且呈剂量依赖性。经过青蒿琥酯的干预，无论是5、10、20 mg·kg-1·d-1均可上调大鼠滑膜细胞蛋白及大鼠体内T淋巴细胞对Foxp3的表达。其中以20 mg·kg-1·d-1最为显著，且优于传统治疗类风湿关节炎用药羟氯喹，但与甲氨蝶呤作用相当，略低于甲泼尼龙组。结合以往实验予大鼠体外胃饲青蒿琥酯可明显减轻大鼠关节肿胀及前期发现其可抑制IL-17、TNF-α、MMP3等。本研究认为青蒿琥酯在控制及缓解CIA大鼠的症状有明显作用，其抑制IL-17、TNF-α、MMP3及炎性因子的主要机制可能是通过上调Foxp3的基因及蛋白表达，从而达到抑制炎性因子、治疗类风湿关节炎的目的[15]。

本研究揭示了青蒿琥酯通过调控T淋巴细胞转导信号通路，诱导CD4+T细胞高表达Foxp3，进而调控CD4+Foxp3+Tregs细胞的生长、分化与繁殖，调控身体多个生物学过程以及对机体的免疫功能进行调节。本研究分析了青蒿琥酯可能的治疗靶点，为青蒿琥酯在干预人滑膜细胞提供试验基础并为其用于RA临床治疗的深入研究提供理论依据[16]。

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Expression of Foxp3 in rat collagen-induced arthritis through artesunate intervention*

HongXuezhi,LiuJia,ZhuangChenchen,LinDong,ZhuMengya,MoHanyou△

(DepartmentofRheumatology,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541000,China)

ObjectiveTo investigate the expression of regulatory T cells expressing Foxp3 in rat synovial cells and T lymphocytes of collagen-induced arthritis(CIA) through artesunate intervention and their significance.MethodsThe CIA model in SD rats was established and divided into the control group,CIA model group,CIA and different concentrations of artesunate groups,CIA and methotrexate(MTX)group,CIA and hydroxychloroquine (HCQ) group,CIA and methylprednisolone(MP) group.The lymphocytes were extracted from spleen.The expression of Foxp3 in different groups of CIA rats were detected by flow cytometry (FCM).The immunohistochemical method was used to detect Foxp3 expression in rats ankle synovial cells.ResultsFoxp3 expression in spleen lymphocyte and synovial tissue in CIA and 20 mg·kg-1·d-1artesunate group was obviously higher than that in other artesunate groups,CIA and hydroxychloroquine group(P<0.05),but the expression of Foxp3 in the CIA and spleen lymphocytes had statistical difference compared with CIA and methylprednisone group and had no statistical difference compared with the CIA and methotrexate group(P>0.05).ConclusionArtesunate can up-regulate the expression of Foxp3 in T lymphocytes and synovial tissue,moreover is positively correlated with the dosage.When the dose is 20 mg·kg-1·d-1,the effect is most significant.

arthritis,experimental;arthritis,rheumatoid;Foxp3;artesunate

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.13.001

国家自然科学基金资助项目(81160376、81360462)；广西自然科学基金资助项目(2013GXNSFAA019111)。作者简介：洪学志(1989-)，硕士，住院医师，主要从风湿病学研究。△

，Tel:18007730655；E-mail:mohanyou@hotmail.com。

R392.8

A

1671-8348(2016)13-1729-04

2015-11-29

2015-12-16)