液相色谱法测定乳品中维生素A、D、E含量

吴少明

(福建省产品质量检验研究院，国家加工食品质量监督检验中心，福建　福州　350002)



液相色谱法测定乳品中维生素A、D、E含量

吴少明

(福建省产品质量检验研究院，国家加工食品质量监督检验中心，福建福州350002)

采用超高压液相色谱技术，建立了乳品中维生素A、D、E的测定方法。即称取适量样品，在碱性条件下皂化后进行液液萃取，脱水后浓缩至近干，残余物经甲醇溶解定容，过滤膜后进样分析。方法学验证表明，维生素A、D、E的检出限在0.2～10 μg/100 g之间，线性关系良好(R2>0.999)。以奶粉为基质，进行3水平加标回收试验(n=6)，回收率均在94.0%～99.1%之间，RSD为2.1%～6.1%。该方法简单、灵敏度高、重现性好，可普遍应用于乳品中维生素A、D、E的检测。

乳制品；维生素A、D、E；高效液相色谱

乳制品中含有非常丰富的维生素A、D、E，是孩子生长发育所不可缺少的营养成分。近年来，乳制品安全等一系列食品安全事件后， 国家对乳制品安全监管更加重视，而检测能力是保障食品安全的第一道屏障。目前，气相色谱法，试剂盒法，分光光度法和高效液相色谱法是测定脂溶性的维生素含量的主要方法[1-13]。但在实际测定中，种种原因导致很难获得稳定、准确的数据。

本文通过对整个测定过程中各因素条件改变对结果的影响，建立一种简单、快捷、准确度高的超高压液相色谱法，可普遍应用于乳制品中维生素A、D、E的检测。

1　实　验

1.1仪器

超高效液相色谱仪：美国 waters，配制waters PDA 2996 检测器。

1.2材料与试剂

维生素A(纯度99%)、维生素D2、D3(纯度99%)、维生素E(纯度98.5%)，德国Dr.Ehrenstorfer公司；除乙腈和甲醇为色谱纯外其余所用试剂均为分析纯。

1.3实验方法

1.3.1色谱条件

色谱柱(BEH 柱，2.1×100 mm, 1.7 μm，Waters公司)；流动相：甲醇/水(92:8)；流速：0.3 mL/min；进样量：2.0 μL；柱温：35 ℃。检测波长：VA、VD、VE分别为325、265、290 nm。

1.3.2标准溶液的配制

分别准确称取适量维生素A、D、E标准品于各10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容至刻度，充分混匀得到浓度约为1.0 mg/mL标准储备液，于-24 ℃冰箱中放置保存。再分别取适量标准储备液用甲醇稀释至浓度为20.0 μg/mL的标准使用液，其中VE为200 μg/mL。

1.3.3标准系列的配制

分别取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL的标准使用液于5个 10 mL容量瓶中，以甲醇稀释定容后，制得VA、VD浓度为1.0、2.0、5.0、10、20 μg/mL；VE为10、20、50、100、200 μg/mL的标准系列。

1.3.4测定方法

准确称取约10 g样品(液态为50 mL)，加入1.0 g抗坏血酸、10 g氢氧化钾、50 mL无水乙醇以及25 mL超纯水，摇匀后在60 ℃水浴中皂化20 min，待其冷却，以两次100 mL石油醚进行新型液液萃取，萃取液经无水硫酸钠脱水后旋转蒸发浓缩至近干，残余物经甲醇溶解定容，经超声混匀后过 0.45 μm滤膜进样分析。

2　结果与讨论

2.1萃取溶剂

为选取合适的萃取溶剂，以奶粉为基质，加入各标准液1.0 mL，分别采用石油醚、正己烷以及乙醚三种溶剂进行萃取，其余步骤同1.3.4，重复3次试验。结果见图1，以石油醚萃取结果最优，四种维生素回收率在92.8%～98.4%之间，RSD在2.9%～4.9%之间；正己烷萃取时次之，回收率在84.3%～97.7%之间，RSD在3.5%～5.6%之间；而当以乙醚萃取时，效果最差，各维生素回收率仅在74.3%～89.3%之间。此外，结合毒性大小，以及旋转蒸发浓缩速度考虑，最终选择以石油醚作为萃取剂。

图1　萃取溶剂的影响Fig.1　Effect by extraction solvents

2.2萃取次数

图2　萃取次数的影响Fig.2　Effect by extraction times

为确定洗脱溶剂的体积，仍以奶粉为基质，加入各标准液1.0 mL，以3次100 mL石油醚进行萃取，分别将第1、2、3次萃取液单独收集后按步骤1.3.4进行后续试验，重复3次试验。结果如图2所示，第一次100 mL石油醚萃取时，4种维生素的回收率均在74.6%～83.9%之间，RSD在3.1%～5.0%之间；当增至两次时，其回收率升至94.6%～99.3%，RSD在3.1%～5.0%之间；增至3次以上时，结果与两次时相差不大，这说明两次100 mL的石油醚足以将目标物萃取出来，因此选择100 mL 萃取两次。

2.3皂化温度

考虑到奶粉中含有游离脂肪酸会污染仪器，且目标物被蛋白包裹等因素，需对样品进行皂化处理，而皂化温度的不同将有可能影响结果。仍以同样的奶粉为基质进行加标，分别以30、40、50、60、70 ℃下皂化30 min，其余步骤同1.3.3，每种条件重复试验3次。结果见图3，在30～60 ℃之间，随着皂化温度的上升，目标物的回收率成递增趋势，回收率由60%升至98.3%，RSD为3.2%～5.1%之间，其可能原因是在此温度范围内，温度越高，被包被的目标物释放的更完全；而当温度高于60 ℃时结果与60 ℃相近。因此，选择皂化温度为60 ℃。

图3　皂化温度的影响Fig.3　Effect by temperature of saponification

2.4皂化时间

皂化时间的长短也可能影响结果，若时间太短将导致游离脂肪酸去除不全污染仪器，以及目标物释放不完全，而时间过长则会造成浪费或者目标物分解。因此，有必要对皂化温度进行优化。以同样的奶粉为基质进行加标，分别以0、10、20、30、40 min在60 ℃下皂化，其余步骤同1.3.4，重复试验3次。结果如图4所示，在0～20 min之间，随着皂化时间的延长，目标物的回收率缓慢上升，其原因是由于在此时间范围内，时间越长，被包被的目标物释放的更完全；而当增至20 min 以上时，回收率基本不变甚至有所下降，目标物可能分解。在20 min时最佳，回收率在92.5%～97.9%之间，RSD在2.9%～3.6%之间。因此，选择皂化时间为20 min。

图4　皂化时间的影响Fig.4　Effect by time of saponification

2.5新型液液萃

实际样品经皂化后会形成皂角，在液液萃取时会堵住分液漏斗底部，使得液液萃取很难进行，严重影响试验的进度，特别在进行大批量试验时。考虑到这个问题，本人设计了一种新型的液液萃取装置如图5所示，将萃取液从上层直接抽出，轻松地解决了这一难题，大大提高了试验效率。

图5　新型液液萃取装置Fig.5　The new liquid-liquid extraction apparatus

2.6石油醚循环利用

由于每个样品需要200 mL的石油醚，消耗量较大，造成成本的同时也对环境也有污染。因此本人试着对旋转蒸发后收集的石油醚进行循环利用的可行性进行试验，从本底、干扰、以及对仪器的污染程度等进行考察。结果表明回收的石油醚对再次试验并无影响，完全可以循环利用。

2.7方法学指标考察

2.7.1检出限

在奶粉基质中，VA、VD2、VD3和VE的检出限(LOD，S/N=3)分别为0.5 μg/100 g、0.2 μg/100 g、0.2 μg/100 g和10 μg/100 g(见表1)，该方法的检出限、定量限也较低，可满足痕量分析要求。

表1　检出限和回归方程Table 1　the detection limit and the regression equation

2.7.2线性范围

以4种维生素的峰面积Y和浓度X(μg/mL)计算线性回归方程。在最优条件下进行方法学验证实验，结果如表1所示，在相应的浓度范围内线性关系良好，相关系数R2都在0.9994以上。

2.7.3精密度和准确度

选取含有较低水平维生素的奶粉为基质，将4种维生素标样混合加入，在最优条件下进行3个水平的加标回收试验，每个水平重复6次，结果见表2。4种维生素的回收率在94.0%～99.1%之间，RSD为2.1%～6.1%之间，这说明本方法的重现性(精密度)和准确度均较为理想，满足分析的要求。

表2　回收率和RSD测定结果 (n=6)Table 2　Recovery and RSD measurement results(n=6)

2.8实际样品分析

利用本方法调查了12种(50份)常见品牌奶粉中的维生素ADE含量(4种维生素的谱图见图6。结果表明，维生素A的含量在206～651 μg/100 g之间；维生素D3的含量在1.2～12.4 μg/100 g之间；维生素E的含量在0.6～12.8 mg/100 g之间；而维生素D2均未检出(

图6　维生素A、D、E色谱图Fig.6　Chromatograms of Vitamin A, D, E

3　结　论

采用新型液液萃取法，结合超高压液相色谱(UPLC)技术，建立了检测乳制品中维生素A、D、E的方法，并对前处理条件进行了优化。对比国标GB5413.9[14]所建立的方法更简单、快速、灵敏度更高，重现性好。此外，所发明的新型液液萃取装置很好了解决了赌塞的情况，且证实了石油醚可以回收利用，既降低了实验成本，又减少了环境污染。并将所建立的方法应用的实际的样品测定中，取得了较好的结果。

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Determination of Vitamin A, D, E from Dairy Products by Ultra High Pressure Liquid Chromatography

WUShao-ming

(National Quality Supervision and Testing Center for Processed Food, Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality, fujian Fuzhou 350002, China)

A new method was established for determination vitamin A, D, E from dairy products by ultra-high pressure liquid chromatography (UPLC) technology. Sample was saponificated under alkaline conditions, and then by liquid-liquid extraction, dehydrated and concentrated to nearly dry, the residue was dissolved in methanol, flitted and analysis. Limit of detection (S/N=3) and limit of quantization of vitamin A, D, E were 0.2～10 μg/100 g. There was an excellent linear correlation (r2>0.999) of vitamin A, D, E. When infant formula powder was spiked with vitamin A, D, E at three levels (n=6), the average recoveries were 94.0%～99.1%, and relative standard deviation(RSD)was 2.1%～6.1%, respectively. The established method is simple, fast high sensitivity, good reproducibility. The method can be adapted to detection vitamin A, D, E from dairy products.

dairy products; vitamin A, D, E; high performance liquid chromatography

吴少明(1986-)，男(汉)，工程师，硕士，研究方向：食品质量与安全。

O657

A

1001-9677(2016)08-0130-04