舒尼替尼通过抑制Akt/mTOR信号通路诱导肾癌细胞自噬

曹　珮，姜学军，席志军△

(1. 北京大学第一医院泌尿外科，北京大学泌尿外科研究所， 北京　100034; 2. 中国科学院微生物研究所， 北京　100101)



·论著·

舒尼替尼通过抑制Akt/mTOR信号通路诱导肾癌细胞自噬

曹珮1，姜学军2，席志军1△

(1. 北京大学第一医院泌尿外科，北京大学泌尿外科研究所， 北京100034; 2. 中国科学院微生物研究所， 北京100101)

目的：研究舒尼替尼引起的肾癌细胞出现细胞自噬的机制。方法：以肾癌细胞系ACHN细胞为细胞模型，利用3-(4，5-二甲基)-5-(3-羧甲基苯环)-2-(4-硫基苯)-2H-四唑盐复合物[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，innersalt，MTS]检测法观察舒尼替尼对ACHN 细胞活性的影响；应用RNA干扰技术敲降自噬相关蛋白Beclin1和微管相关蛋白1轻链3融合蛋白(microtubule associated protein 1 light chain 3 fusion protein, LC3)检测自噬与舒尼替尼引起的细胞凋亡。使用电子显微镜和荧光显微镜观察在舒尼替尼作用下自噬体的形成；蛋白质免疫印迹检测舒尼替尼对LC3-Ⅱ的积累，自噬相关信号通路蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)、哺乳动物雷帕霉素受体( mammalian target of rapamycin, mTOR) 及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶( poly ADP-ribose polymerase，PARP) 切割的变化和过量表达，以及敲降Akt检测诱导自噬的变化。结果: 舒尼替尼能显著抑制ACHN的细胞活性，这种作用具有时间和浓度依赖性；敲降自噬相关蛋白Beclin1和LC3减少自噬可改变舒尼替尼引起PARP的切割；透射和荧光显微镜观察结果表明，舒尼替尼引起细胞自噬体明显增加；蛋白质免疫印迹结果显示舒尼替尼增加自噬同时减少了Akt/mTOR的磷酸化。过量表达持续活化的Akt抑制了该化合物引起的自噬，而敲降Akt可促进自噬发生。mTOR抑制剂雷帕霉素能上调舒尼替尼引起的自噬并促进细胞活性的丢失。结论：舒尼替尼通过抑制Akt/mTOR信号通路促进肾癌细胞ACHN的自噬，其诱导的自噬与凋亡有关。

癌,肾细胞；细胞自噬；细胞凋亡；舒尼替尼；信号传导

肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是起源于肾小管上皮的恶性肿瘤，是最常见的泌尿系恶性肿瘤之一，约80%～95%的原发性肾恶性肿瘤为肾细胞癌，因具有多耐药基因等机制，肾癌对化疗和放疗均不敏感。2005年，美国食品药品管理局批准首个靶向治疗药物索拉非尼(sorafenib)上市，之后又陆续出现针对包括血管内皮生长因子受体在内的多种靶向治疗药物，其中舒尼替尼(sunitinib)是最具代表性的药物，可以有效延长晚期肾细胞癌患者的肿瘤特异生存时间和总生存时间[1]，作为多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂，舒尼替尼通过作用于血管内皮生长因子受体、血小板衍生内皮生长因子受体等靶点，一方面直接抑制肿瘤生长，一方面通过抑制肿瘤新生血管生成而间接抑制肿瘤生长[2]。

自噬是真核生物中普遍存在的现象，可分为巨自噬、微自噬以及分子伴侣介导的自噬。根据降解目标的不同，自噬又可以分为核自噬、线粒体自噬、过氧化物酶体自噬[3]。自噬作为一种适应性机制，当细胞在恶性环境比如营养缺乏时，自噬可以主动降解一些过剩的细胞器和胞内物质，从而降低细胞对能量消耗，同时降解产生的小分子物质用于提供能量和作为其他物质合成的底物，维持细胞生存[4]，但是过度的自噬也会导致细胞死亡，即自噬性细胞死亡，随着对凋亡的研究，自噬性细胞死亡为肿瘤治疗提供了新的思路[5]。自噬的信号通路主要为两种：腺苷酸活化激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK) 信号通路和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白( phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR)信号通路，前者主要受胞内能量水平影响，而后者主要感受营养状况和生长因子等多种胞外影响因素，调控细胞周期、翻译、转录和代谢[6]，其中PI3K/Akt/mTOR通路在肿瘤的发生发展中起重要作用。有研究表明[7]，在肾癌中PI3K/Akt/mTOR 信号途径上调S期激酶相关蛋白2 蛋白表达，从而激活mTORC1，进而促进细胞增殖。此外，活化的Akt也可能有助于肾细胞癌的血管生成[8]。已有实验表明[9]，在透明细胞性肾细胞癌使用PI3K 抑制剂LY294002 或Akt 抑制剂后，基质金属蛋白酶-2水平明显降低，该酶与肿瘤转移有关，但是，目前有关舒尼替尼对PI3K/Akt /mTOR、肾癌细胞自噬的影响及二者关系的报道较少，本研究旨在明确舒尼替尼对自噬和PI3K/Akt /mTOR的影响，进而探讨舒尼替尼引起ACHN自噬的作用机制，为肾细胞癌靶向治疗提供实验依据。

1　材料与方法

1.1细胞和质粒

ACHN细胞购自美国ATCC 公司；质粒myrAkt1(9008)、 myrAkt2(9016)购自美国Addgene公司，于中国科学院微生物研究所姜学军实验室保存。

1.2药品和抗体

氯喹(chloroquine diphosphate salt, CQ，C6628)、雷帕霉素(R0395)及多克隆LC3-ⅡB抗体购自美国Sigma Aldrich 公司，Z-VAF-FMK(FMK001) 购自美国R&D systems 公司，p-mTOR(Ser2448、2971)、mTOR (2972)、p-Akt (Ser473、9271)、totle-mTOR(4691)、totle-Erk1/2(9102)、PARP抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司，Beclin1 、LC3-Ⅱ、Akt1、Akt2、Akt3特异性siRNA 与对照siRNA 购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，Actin抗体购自北京中杉金桥公司。

1.3仪器设备

CO2细胞培养箱购自日本Panasonic SANYO公司，小型台式离心机购自美国Thermo公司，台式冷冻高速离心机购自美国Sigma-Aldrich 公司，-20 ℃低温冰箱购自中国海尔公司，-80 ℃低温冰箱购自德国Heraeus 公司，AL204 电子天平购自美国Mettler Toledo公司，正置荧光显微镜(Axio Imager A1) 购自德国Zeiss 公司，mini Trans-Blot 电转仪购自美国Bio-RAD 公司，AE-6500 型电泳槽购自日本ATTO 公司，JY600C 恒压恒流电泳仪购自中国北京君意东方电泳设备有限公司，MilliQ plus 超纯水系统购自美国Millipore 公司，Biospec-nano UV-VIS 分光光度计购自日本岛津公司。

1.4试剂耗材

DMEM 培养基和胎牛血清购自美国GIBCO 公司，青链霉素混合物和胰蛋白酶消化液购自南京凯基生物科技发展有限公司，PVDF膜购于美国Amersham公司，发光液购于美国Thermo公司，Attractene 转染试剂购于德国QIAGEN公司。

1.5细胞培养

ACHN细胞用10%(体积分数) 胎牛血清和1%(质量分数)青链双抗的DMEM培养基，置于37 ℃ 5%(体积分数)CO2细胞培养箱中进行培养，当细胞生长密度达到80%时弃去旧培养基，用PBS 洗1 遍，用胰酶消化贴壁细胞，然后以1 000 r/min 离心3 min 后收集细胞，弃去上清液，加入新鲜培养基重悬。将细胞分到6孔板内，37 ℃ 5%CO2细胞培养箱中进行培养过夜，使细胞生长至60%～70%，按需要浓度加入舒尼替尼和其他化合物处理指定时间后收集细胞。

1.6siRNA干扰

在准备siRNA 干扰实验12 h前，把所需细胞以上述方法按30% 密度接种于培养皿中。参考转染试剂说明书将siRNA 和转染试剂分别加入无血清DMEM 培养基中，静置5 min 后混合，再次静置20 min，将混合好的DMEM 培养基加入换为新培养基(含血清) 的细胞培养皿中，干扰36 h后再次更换新鲜培养基，按需要浓度加入舒尼替尼和其他化合物处理指定时间后收集细胞。

1.7细胞质粒转染

将细胞按上述方法分到6 cm培养皿中，37 ℃ 5%CO2细胞培养箱培养过夜，至细胞密度达60%～70%。用Attractene 转染试剂转染myrAkt1或myrAkt2质粒，24 h后将转染后细胞接种于6孔板中，培养过夜，加入舒尼替尼(4 μmol/L)处理2 h后收集细胞。

1.8电子显微镜样品的制备

将ACHN细胞接种于直径6 cm 的培养皿中，于37 ℃ 5%CO2细胞培养箱中培养过夜，至细胞密度达到60%～70%。换新鲜培养基，按8 μmol/L终浓度加入舒尼替尼和DMSO处理4 h。完成处理时间后立即用胰酶消化细胞，4 ℃ 1 000 r/min离心5 min 后收集细胞，冷PBS 洗涤两遍。加入3%(体积分数) 戊二醛溶液，4 ℃过夜固定，送样检验。

1.9荧光显微镜观察

所需细胞以前述方法按80%密度接种于有盖玻片的6孔板中，培养12 h。按8 μmol/L 终浓度加入舒尼替尼处理4 h后取出爬片，用4%(体积分数)多聚甲醛溶液室温固定15 min，而后用PBS洗3遍，穿透液组成 100 mL PBS, 1%(体积分数) Triton X-100, 0.5%(体积分数) BSA,穿透15 min, 一抗室温避光孵育1 h，PBS洗3遍，二抗室温避光孵育1 h，PBS洗3遍，最后用DAPI 染色并封片。制作好的细胞爬片以荧光显微镜观察LC3-Ⅱ荧光聚集情况。

1.10蛋白质免疫印迹

按指定时间处理细胞，弃去培养液，用冷PBS洗1遍，加入一定量的细胞裂解液，裂解液组成: 1 mL 母液[1%(体积分数)Triton X-100， 10%(体积分数)甘油，50 mmol /L Hepes，pH 7.4]，2.5 mol /L NaCl 20 μL，0.5 mol /L EGTA/EDTA 10 μL，0.1 mol /L NaF 10 μL，0.1 mol /L PMSF 20 μL，1 mol/L DTT 2 μL，0.5 mol/L Na3VO42 μL，蛋白酶抑制剂1 μL。然后用细胞刮铲均匀收集培养皿所有部位的细胞移入离心管内，加入相当于裂解液一半体积的上样缓冲液，96 ℃ 煮样30 min后，室温离心13 000 r /min 15 min，收集上清液。等量样品经过8%或13.5%(质量分数)SDS-PAGE 分离蛋白，并上样跑胶分离蛋白质，之后将蛋白质转移至PVDF 膜上。将转有蛋白质的PVDF膜于5%(质量分数)奶粉封闭液室温封膜60 min，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育60 min，经适当漂洗后涂抹发光液，并于暗室曝光洗片，最后将底片扫描并进行分析。

1.11MTS检测细胞存活率

将5 000～10 000个细胞消化并均匀接种于96 孔板中，每孔体积为100 μL，培养过夜后换无酚红DMEM(含10%胎牛血清)培养基。每3 个孔为一组平行对照，未干扰的细胞按2 μmol/L和8 μmol/L 的终浓度加入舒尼替尼，37 ℃ 5%CO2细胞培养箱中分别进行培养24、48和72 h。每孔加MTS 和PMS(20 ∶1) 混合溶液20 μL，使用酶联免疫检测仪于492 nm 波长测定各孔光密度(D)值。

1.12统计学分析

使用SPSS18.0软件进行统计学分析，MTS 实验结果以单因素方差分析和Student-Newman-Keuls(S-N-K) 法两两比较分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2　结果

2.1舒尼替尼引起细胞活性丢失，该作用与细胞自噬有关

舒尼替尼作为肾癌靶向治疗药物，对肾癌细胞具有杀伤作用，MTS实验印证了这一点，在不同浓度(2、8 μmol/L)舒尼替尼的作用下，ACHN活性逐渐降低，以8 μmol/L组活性最低，即浓度依赖；同时，对ACHN细胞处理不同时间(24、48、72 h)发现舒尼替尼的细胞毒作用存在时间依赖性(图1A)。相同处理时间3组(DMSO、舒尼替尼2 μmol/L、舒尼替尼8 μmol/L)活性差异有统计学意义(24 h：F=705.6，P=7.6×10-8；48 h：F=519.1，P=1.9×10-7；72 h：F=329.8，P=7.3×10-7)，之后使用S-N-K 法两两比较发现，任意两组间比较差异也均有统计学意义。Beclin1和LC3是自噬不可缺少的蛋白质，在自噬体的形成过程中起关键作用。敲降Beclin1或LC3导致自噬体不能形成，造成细胞低自噬水平，用终浓度为8 μmol/L舒尼替尼刺激细胞，PARP相对于空白对照组切割增多，表明舒尼替尼引起的细胞凋亡与自噬有关(图1B)。

MTS assay was taken as the cells were treated for 24, 48, 72 hours by sunitinib (2, 8 μmol/L). The cell viability loss induced by sunitinib was concentration-dependent and time-dependent. One-way ANOVA was used to test whether there exists the difference among three groups (DMSO, sunitinib 2 μmol/L, sunitinib 8 μmol/L ) in the 24-hour group, 48-hour group and 72-hour group .The result has statistical significance (24-hour group: F=705.6, P=7.6×10; 48-hour group: F=337.3,P=1.9×10； 72-hour group: F=329.8, P =7.3×10). And there are statistical differences between any two groups of DMSO, sunitinib 2 μmol/L, sunitinib 8 μmol/L tested by S-N-K after one-way ANOVA(A). After knocking down Beclin1 or LC3 (siBeclin1, siLC3) the ACHN were treated with sunitinib (8 μmol/L) for 4 hours. Then harvested cells and analyzed the indicating protein by immunobloting. Compared against mock (control siRNA), sunitinib-induced cleavage of PARP increased. c, cleavage(B).
图1舒尼替尼引起ACHN活性丧失，该作用与自噬有关
Figure 1Sunitinib (ST) induced cell vialibility loss in ACHN, correlated with autophagy

2.2舒尼替尼诱导ACHN细胞自噬增强

透射电子显微镜是观察细胞自噬最可靠的方法之一， 也是首先发现并报道自噬的方法[10]。 电子显微镜下发现用舒尼替尼(8 μmol/L)处理ACHN细胞4 h后，细胞中的自噬体数量较对照组明显增加(图2A)。LC3-Ⅱ被认为是自噬的特异性标志，细胞自噬活动较弱时LC3-Ⅱ弥散分布于细胞中且多位于细胞核中，当自噬活动增强时游离的LC3-Ⅰ聚集到胞质自噬体上并经蛋白酶水解及脂化作用形成LC3-Ⅱ，呈现点状聚集[3]。本实验荧光显微镜显示舒尼替尼(8 μmol/L)刺激ACHN细胞4 h后，内源性LC3-Ⅱ在胞质中增多，且荧光聚集程度增高(图2B)。

前面提到，LC3以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式存在，前者与自噬体膜上的磷脂酰乙醇胺结合成为LC3-Ⅱ。在自噬增强时，LC3-Ⅰ脂化形成的LC3-Ⅱ增多，从而使LC3-Ⅱ含量增加,因此利用免疫杂交印迹检测了经不同浓度舒尼替尼(1、2、4、8 μmol/L)处理4 h后ACHN细胞中LC3-Ⅱ与内参肌动蛋白Actin，发现随着舒尼替尼浓度的增加(1、2、4、8 μmol/L)，LC3-Ⅱ/Actin的比值明显增加。氯喹阻断自噬体和溶酶体融合,抑制LC3-Ⅱ的降解，同时应用舒尼替尼和氯喹，LC3-Ⅱ/Actin值仍明显上升，舒尼替尼联合应用氯喹时LC3-Ⅱ/Actin的值与单独应用舒尼替尼的值之比(fold)大于1，说明LC3-Ⅱ的增加是由舒尼替尼诱导自噬流增强导致的(图2C)。需要指出的是，在舒尼替尼浓度为8 μmol/L时fold值小于1，可能存在其他机制参与其中。

Akt/mTOR通路通常认为是自噬的重要调节通路之一，mTOR可负向调节自噬过程。在ACHN细胞中可以看到，随着浓度增加(1、2、4、8 μmol/L), mTOR及其上游调节蛋白的AKT的磷酸化逐渐被抑制，说明了舒尼替尼可通过抑制Akt/mTOR通路进而激活自噬过程(图2D)。

2.3舒尼替尼通过抑制Akt/mTOR通路诱导肾癌细胞自噬

雷帕霉素是mTOR的特异性抑制剂，通过与细胞内受体FKBP-12结合形成复合物后直接作用于mTOR中的FBKP12雷帕霉素结合位点(FKBP-12-rapamycin binding，FRB)而抑制蛋白活性。舒尼替尼(4 μmol/L)联合雷帕霉素处理组LC3-Ⅱ 积累大于舒尼替尼(4 μmol/L)单独处理组，故雷帕霉素可以增强舒尼替尼的自噬诱导作用(图3A)。同样，利用RNA干扰技术分别敲降Akt各亚基的表达可以看到，舒尼替尼(4 μmol/L)在敲降Akt2、Akt3的ACHN细胞中自噬诱导作用强于空白对照组，Fold值均为1.5，大于对照组中的1.1；而在敲降Akt1时表现为抑制自噬的作用，说明在自噬中Akt的3个亚基作用可能不同(图3B)。在Akt1和Akt2亚基过表达时，同时加入氯喹和舒尼替尼时Fold值小于对照组，说明其自噬减弱(图3C)，以上结果说明舒尼替尼诱导自噬的作用是通过抑制AKT/mTOR通路实现的。

ACHN cells were observed by transmission electron microscope to detect the autophagic vacuoles. Compared to control, the group treated by sunitinib(8 μmol/L) for 4 hours showed more autophagosomes (A). LC3-Ⅱ were detected by immunofluorescence and positive dots translocation from nuclear to cytoplasm and more aggregation of LC3 could be observed in cells treated with sunitinib ( 8 μmol/L ) for 4 h (B). ACHN were treated with sunitinib (1, 2, 4, 8 μmol/L) for 4 hours and harvested as mentioned above. The gray value represented the number of protein, and the ratios of LC3-Ⅱ to Actin were presented below the blots. Chloroquine (CQ) combined with sunitinib could verify that increase of LC3-Ⅱ was due to induced autophagic flux (C). Accompanied with accumulation of LC3-Ⅱ, phosphorylation of Akt and mTOR decreased (D). Ctrl, control; ST, sunitinib; CQ, chloroquine diphosphate salt; p, phosphorylation; t, total.
图2舒尼替尼增强ACHN细胞自噬并抑制Akt/mTOR的磷酸化
Figure 2Sunitinib strengthened the autophagy in ACHN and suppressed the phosphorylation of Akt and mTOR

3　讨论

舒尼替尼作为受体酪氨酸激酶抑制剂，在肾癌靶向治疗中有重要的作用，被国内外肾癌治疗指南中定位为晚期肾癌的一线治疗药物。自噬的发生可能是一种适应性反应，在细胞处于能量缺乏下维持细胞能量供需平衡，这一作用对于处于高代谢状态下的肿瘤细胞尤为重要。自噬也可作为一种程序性死亡的方式，并且与凋亡存在机制上许多重叠的部分。

虽然舒尼替尼引起肾癌细胞自噬的研究尚未见报道，但已有舒尼替尼对其他细胞自噬、凋亡作用的报道，如在研究舒尼替尼引起的心脏毒性时，发现舒尼替尼作用于心肌细胞H9C2时可以引起细胞自噬介导的细胞死亡[11]，在膀胱癌的研究中发现，舒尼替尼可以引起膀胱癌细胞出现细胞自噬依赖的细胞死亡[12]，而另一个基于多种肿瘤细胞系的研究发现，舒尼替尼可以引起这些细胞的凋亡，而自噬抑制剂氯喹能够协同舒尼替尼的细胞毒作用[13]。本研究设计抑制自噬的情况，观察舒尼替尼对肾癌细胞的作用，结果发现抑制自噬可以减弱舒尼替尼的细胞毒性，提示自噬协同舒尼替尼对肾癌有杀伤作用。PI3K/AKT/MTOR信号通路参与多种肿瘤的发生发展，可以作为肿瘤治疗的又一靶点。在肾细胞癌裸鼠模型，PI3K抑制剂LY294002可以抑制Akt磷酸化和肿瘤生长[14]。mTOR抑制剂已在临床上用于肿瘤的治疗， mTOR抑制剂依维莫斯可以用于舒尼替尼治疗失败的晚期肾癌的治疗。mTORc1是mTOR抑制剂的主要作用靶点，在抑制剂的作用下抑制促细胞分裂作用。雷帕霉素是一种研究较多的mTOR 抑制剂，通过抑制mTOR下游的p70s6k 和4E-BP1分子，抑制细胞由G1进入S期的转录和翻译，发挥抑制mTOR 的作用。此外，有研究发现，在肾癌动物细胞模型mTOR 抑制剂与血管内皮生长因子抑制剂(如舒尼替尼)具有协同抗肿瘤作用[15]。本研究干预Akt/mTOR信号通路，显示舒尼替尼引起肾癌细胞自噬活动增强，明确了舒尼替尼通过抑制Akt/mTOR信号通路诱导自噬。虽然已有证据显示舒尼替尼对Akt/mTOR信号通路的作用，但具体的机制并不十分清楚，而且自噬对肿瘤的影响非常复杂，不同的药物、不同的肿瘤中自噬的作用以及发生机制都可能不同[16]，仍需要深入研究。

Combined with mTOR inhibitor rapamycin, the ratios of LC3-Ⅱ to actin raised (A). Knocking down subunits of Akt, the sunitinib-induced autophagy could be enhanced as well (B). Overexpression of Akt subunits surpressed autophagy (C). CQ, chloroquine diphosphate salt.
图3舒尼替尼通过抑制AKT/mTOR信号通路诱导ACHN自噬
Figure 3Sunitinib (ST) induced autophagy via suppressing Akt/mTOR pathway in ACHN

综上所述，本研究发现舒尼替尼可以引起肾癌细胞出现与细胞凋亡相关的自噬增加的现象，并阐明了其作用的部分机制，一方面补充了舒尼替尼治疗肾癌的部分作用机制，另一方面也为联合自噬调节药物与分子靶向药物的新的治疗方式提供了理论

基础。

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(2016-04-09 收稿)

(本文编辑：王蕾)

Sunitinib induces autophagy via suppressing Akt/mTOR pathway in renal cell carcinoma

CAO Pei1, JIANG Xue-jun2, XI Zhi-jun1△

(1. Department of Urology， Peking University First Hospital; Institute of Urology， Peking University， Beijing 100034，China; 2. Institute of Microbiology， Chinese Academy of Science， Beijing 100101， China)

Objective： To determine the mechanism of sunitinib-induced autophagy in renal cell carcinoma cells. Methods: MTS assay was applied to detect the cell viability alteration under the treatment of sunitinib (2, 8 μmol/L). The sunitinib-induced autophagy as well as cell apoptosis was measured and compared after knocking down autophagy-related protein Beclin1 and microtubule associated protein 1 light chain 3 fusion protein (LC3) by RNA interference. The transmission electron microscope was used to observe the formation of autophagosomes in ACHN cells. The fluorescence microscope was used to monitor distribution and aggregation of endogenous LC3-Ⅱ. The expressions of protein such as LC3-Ⅱ, the autophagic regulation molecules protein kinase B/ mammalian target of rapamycin (Akt/mTOR) and the symbol of apoptosis poly ADP-ribose polymerase (PARP) were capable to be detected by immunoblotting assay. Results: Sunitinib was able to significantly trigger cell viability loss in the renal carcinoma cell ACHN, which was both in a concentration-dependent and time-dependent manner (P<0.05). After reducing the autophagy by knocking down Beclin1 and LC3, the number of cleavage of PARP was increased remarkably, whereas there was nearly not any cleavage in the mock group. By the transmission electron microscope, there were more autophagic vacuoles in ACHN cells after being administrated with sunitininb compared with the control. And the nuclear-to-cytosol translocation as well as aggregation of LC3-Ⅱ was presented after sunitinib treatment by the fluorescence microscope, which was the proof of the enhanced autophagy. According to the immunoblotting, sunitinib was able to increase the accumulation of LC3-Ⅱ. At the same time, the result of sunitinib combined with chloroquine, a drug which blocked the fusion of autophagosomes and lysosomes, demonstrated that the increasing amount of LC3-Ⅱ was due to the enhanced autophagy flux by sunitinib treatment in ACHN cells. However, phosphorylation of Akt as well as mTOR was decreased at the same time. The rapamycin (mTOR inhibitor) or knocking down Akt subunits could change the sunitinib-induced LC3-Ⅱ accumulation, whereas overexpression of Akt subunits decreased the autophagic flux, indicating that Akt/mTOR was the target of sunitinib in autophagy. Conclusion: Sunitinib induced autophagy via suppressing Akt/mTOR pathway, and the auto-phagy was involved in apopotosis.

Carcinoma, renal cell; Autophagy; Apoptosis; Sunitinib; Signal transduction

国家自然科学基金(81272829)资助Supported by the National Natural Science Foundation of China (81272829)

R737.1

A

1671-167X(2016)04-0584-06

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.04.003

△Corresponding author’s e-mail, xizhijun@hsc.pku.edu.cn

网络出版时间：2016-7-413：11：08网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160704.1311.002.html