2，4-二氯苯氧乙酸人工抗原合成及多克隆抗体的制备

王秋艳　张宁　秦朝秋　牛承辉

（辽宁出入境检验检疫局　辽宁大连　116001）

2，4-二氯苯氧乙酸人工抗原合成及多克隆抗体的制备

王秋艳张宁秦朝秋牛承辉

（辽宁出入境检验检疫局辽宁大连116001）

采用碳化二亚胺法，将2，4-二氯苯氧乙酸 （2，4-D）分别与牛血清白蛋白 （BSA）及卵清蛋白（OVA）偶联，得到完全免疫原2，4-D-BSA和包被原2，4-D-OVA，采用紫外扫描法判定偶联结果；用2，4-D-BSA免疫新西兰大耳白兔，采用间接酶联免疫吸附测定法测定多抗血清效价、阻断酶联免疫吸附测定法测定其抑制曲线。结果表明：BSA与2，4-D偶联后，波峰出现右移，且具有2，4-D特征峰，表明偶联成功；2只新西兰大耳白兔血清效价均达到了1∶5.12×105，且B号兔子多抗血清敏感性最好，半数抑制浓度IC50为47.64 ng/mL，表明成功获得了高效价、特异性好、亲和力较高的兔源抗2，4-D多克隆抗体血清，为2，4-D残留免疫学检测方法的建立奠定了良好基础。

2，4-二氯苯氧乙酸；人工抗原；兔源多抗血清

1　前言

2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）是人工合成、类似于生长素的一种植物生长调节剂，分子式为C8H6C12O3，白色粉末，属于苯氧羧酸类物质，强酸性，较易溶于碱溶液、醇类和乙醚，不溶于石油和钠盐。2，4-D是常用的除草剂和植物生长调节剂［1］，能够促进细胞伸长和分裂、新器官的分化和形成，此外还可以防止果实脱落［2］。但是，2，4-D可以通过皮肤和呼吸系统进入体内，刺激人体分泌大量的雌性激素，干扰内分泌系统，对生殖和免疫系统产生不良影响，具有潜在的致癌性和致突变性，许多国家都制定了该化合物在农产品中的残留限量。目前，2，4-D残留的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、气-质联用或液-质联用法等［3］。色谱法具有分离速度快、检测效率高、重现性好、灵敏度高等显著优点，但由于前处理比较复杂、仪器昂贵、技术难度大、检测费用高而且需要专业的技术人员等不足，难以应对大批量样品的快速检测，大大限制了其广泛应用。因此，研制特异、敏感、快速、简便的2，4-D检测方法具有十分重要的意义。

2　材料与方法

2.1材料

2.1.1试剂

2，4-D标准品（纯度大于98%）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、碳化二亚胺（EDC）：购于Sigma公司；弗氏不完全佐剂（FCA）、弗氏完全佐剂（FIA）：Gibco产品；卵清蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）：购于Pierce公司；羊抗兔酶标二抗：购于生工生物工程（上海）有限公司；其他相关试剂均为分析纯。

2，4-D标准溶液：以无水二氧六环助溶，0.01 mol/L pH 7.4 PBS缓冲液为稀释液，然后根据所需浓度进行配制；包被液（CBS）：为0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液；洗液 （PBST）：为含0.05%（v/v）Tween-20的PBS；阻断ELISA和间接ELISA所用的封闭液：为含5%猪血清（v/v）的PBST溶液；终止液：为2 mol/L的硫酸溶液。

2.1.2仪器

紫外扫描仪：日本岛津公司；SpectraMax M5全自动酶标仪：美国美谷分子。

2.1.3实验动物

4月龄的雌性新西兰大白兔：购自大连医科大学实验动物中心。

2.2方法

2.2.1人工抗原的合成

称取15 mg 2，4-D溶于1.5 mL无水二氧六环试剂中，分别加入90 mg 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 （EDC·HCl），53.5 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），室温下搅拌反应6 h，即为2，4-D活化液。称取40 mg BSA溶于6 mL碳酸盐缓冲溶液中，即为BSA溶液。向BSA溶液中缓慢加入2，4-D活化液0.8 mL，室温下磁力搅拌过夜；将反应液放入透析袋，在500 mL的0.01 M的PBS中透析4次，制得2，4-D与BSA的偶联物（2，4-D-BSA），保存在4℃的PBS中，备用。用同样的方法偶联鸡OVA，制得包被原2，4-D-OVA。

2.2.2人工抗原的鉴定

用PBS稀释2，4-D、BSA和2，4-D-BSA至合适溶度，在波长200-380 nm进行紫外扫描，根据吸收峰的变化判断偶联是否成功。

2.2.3多克隆抗体的制备及检测

2.2.3.1多克隆抗体的制备

取4月龄新西兰大白兔2只，用制备好的免疫原2，4-D-BSA免疫，初免剂量为1.0 mg/只，二免、三免、四免剂量为0.5 mg/只。背部皮下多点注射，共免疫4次。首免，用无菌PBS稀释2，4-D-BSA与等量弗氏完全佐剂（FCA）混合，25000 r/min充分乳化5 min；3周后加强免疫，用无菌PBS稀释2，4-DBSA与等量弗氏不完全佐剂 （FIA）混合，25000 r/ min充分乳化5 min，免疫间隔2周。期间各在三免和四免后的第7天，耳静脉采血1 mL，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测抗血清效价。4次免疫10 d后，颈动脉采全血，用PBS稀释100倍，3000 r/min离心15 min，弃沉淀，上层清液置于-20℃冰箱中备用。

2.2.3.2多抗血清效价测定

采用间接ELISA方法测定多抗血清效价，基本程序参照文献报道的方法［4］并加以改进：2，4-D-OVA包被，包被浓度1 μg/mL，包被量100 μL/孔，4℃过夜，PBST洗板3次；5%猪血清封闭200 μL/孔，37℃温育1 h，洗6次；加多抗血清，100 μL/孔，用封闭液倍比稀释，设阴性对照（NC）和空白对照（BC），37℃温育1 h，洗6次；加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（用封闭液按1∶8000稀释），100 μL/孔，37℃温育45 min，洗6次；加酶底物TMB显色100 μL/孔，室温反应15 min；加入100 μL/孔2 mol/L H2SO4终止反应，读OD450值；结果判断：以待测孔OD450值≥NC OD450值的2.5倍（P/N≥2.5），判为阳性。

2.2.3.3多抗血清抑制曲线测定

采用阻断ELISA鉴定其敏感性。步骤和效价测定相似，不同处在于第1步加OD450值为1.0的兔多抗血清50 μL和不同浓度的2，4-D标准品溶液50 μL作为抑制剂，即测定兔多抗血清对不同浓度2，4-D的抑制率。以吸光率 （B/B0）（B0为2，4-D标准品浓度为0时吸光值，B为2，4-D标准品不同浓度的吸光值）为纵坐标，以不同浓度2，4-D 以10为底的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线，进行相关回归分析，计算多抗血清对2，4-D 的IC50。

3　结果

3.1人工抗原的鉴定结果

利用紫外扫描仪在200-380 nm波长范围进行扫描，BSA的最大吸收峰为278 nm，2，4-D的最大吸收峰为281 nm。BSA与2，4-D偶联后，波峰出现右移，且具有2，4-D特征峰（图1），结果表明偶联成功。

3.2多抗血清的制备及其效价测定结果

间接ELISA法检测四免后兔血清的效价，见图2。结果显示 2只兔血清在四免后抗体效价均达到了1∶1.28×105以上，说明2，4-D-BSA获得了较好的免疫效果，其中B号兔子最高血清效价为1∶2.56×105。

图1　BSA、2，4-D和2，4-D-BSA的紫外扫描光谱

图2　四免后兔血清效价

间接ELISA检测终放后抗血清效价（图3），结果显示，2只兔血清抗体效价均达到了1∶5.12×105以上，表明成功获得了高效价的2，4-D抗血清。

图3　终放后兔血清效价

3.3多抗血清抑制曲线测定结果

由图4可知，B兔子多抗血清标准抑制曲线的线性回归方程为y＝-36.397logx＋61.579，回归系数R2=0.9918，根据回归方程可以计算出多抗血清对2，4-D的IC50为47.64 ng/mL，表明本实验所获得的2，4-D抗血清对2，4-D具有较高的敏感性。

图4　阻断ELISA检测抗血清的IC50

4　讨论

由于2，4-D分子量很小，只有221.04，自身不具有免疫原性，因此需要和载体蛋白质连接起来合成人工免疫原，才能刺激动物的免疫系统产生有效的免疫应答，从而制备抗体。对于小分子物质制备人工抗原时，本身含有NH2、COOH、OH等活性基团，可以利用待测物活性基团加入间隔臂，然后联入载体蛋白就可以成功合成人工抗原，制备特异性良好的抗体。如果自身不含有活性基团或活性基团对药物的特异性和极性影响很大，半抗原要经过改造或从头合成。本研究中2，4-D具有COOH活性基团，为此可以采用碳化二亚胺法，将2，4-D在合适的条件下分别与BSA和OVA偶联，得到完全抗原2，4-D-BSA和2，4-D-OVA。

5　结论

本研究成功合成了2，4-D人工抗原，并以此免疫2只新西兰大白兔，兔子的多抗血清效价均能达到1∶5.12×105，说明成功免疫诱导抗体产生。2只兔子的多抗血清均对2，4-D有抑制，其中B兔子抑制效果最好，IC50为47.64 ng/mL，成功的获得了高效价、特异性好的兔源抗2，4-D的多抗血清，这为2，4-D单抗的制备和免疫学快速检测方法的研究奠定了坚实基础。

［1］刘芯，李德红，李玲.2，4-二氧苯氧乙酸的研究进展［J］.生命科学研究，2004，8（4）：71-75.

［2］庄荣玉.菌毒清与2，4-D混用对温州蜜柑保鲜贮藏的研究［J］.食品与发酵工业，2001，27（12）：31-34.

［3］Giannarellia S，Muscatelloa B，Boganib P，et al.Comparative determination of some phytohormones in wild-type and genetically modified plants by gas chromatography-mass spectrometry and high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Analytical Biochemistry，2010，398（l）：60-68.

［4］ Engvall E，Perlmann P.Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.Quantitative assay of immunoglobulin G［J］.Immunochemistry，1971，8（9）：871.

Synthesis of 2，4-D Artificial Antigen and Preparation of its Polyclonal Antibody

WANG Qiuyan，ZHANG Ning，QIN Zhaoqiu，NIU Chenghui
（Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dalian，Liaoning，116001）

2，4-D separately coupling in carrier protein BSA and OVA by using EDC method.The conjugates of 2，4-D-BSA and 2，4-D-OVA were used as a immunogen and coating antigen respectively. UV was used to identify artificial antigen.New Zealand white rabbits were immunized with 2，4-D-BSA. The titers of polyclonal antiserum was detected by indirect ELISA，the sensitivity of polyclonal antiserum was identified by blocking ELISA.The animal immunization results showed that it was successfully coupled when the wave moved to the right after BSA and 2，4-D was coupling.Two rabbits indirect ELISA titers against 2，4-D were above 1∶5.12×105and the IC50of B rabbit was 47.64 ng/mL，This test was synthesized successfully 2，4-D artificial antigens，2，4-D polyclonal antiserum with high sensibility and specificity was gotten.This polyclonal antibody may lay a foundation for the further 2，4-D monoclonal antibody preparation and the immunology fast detection methods.

2，4-D；Artificial Antigen；Polyclonal Antiserum

Q819

E-mail：lndlwqy@163.com

国家质检总局科技计划项目（2013IK167）

2015-10-27