铁皮石斛对灵芝多糖深层发酵的影响

郑浩然， 杨海龙

(1.温州医科大学仁济学院，浙江温州 325035；2.温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325035)



铁皮石斛对灵芝多糖深层发酵的影响

郑浩然1， 杨海龙2*

(1.温州医科大学仁济学院，浙江温州 325035；2.温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325035)

[目的]研究铁皮石斛对灵芝生长及胞外多糖分泌的影响，并分析灵芝多糖组分的变化。[方法]在发酵培养基中添加不同量的铁皮石斛，分析灵芝生物量和胞外多糖含量的变化，并采用KTA explorer柱层析分析多糖组分。[结果]铁皮石斛可促进灵芝胞外多糖的合成，添加量以10 g/L效果最佳；添加铁皮石斛发酵未改变灵芝多糖的组分。[结论]在灵芝深层发酵培养基中添加适量铁皮石斛有助于灵芝多糖的高效生产。

铁皮石斛;灵芝;多糖;深层发酵

灵芝(Ganodermalucidum) 是我国传统名贵中药，现代药理研究表明，其具有抗衰老、提高机体免疫功能、抑制肿瘤、抗病毒和保肝护肝等作用[1-4]。近年来，灵芝液体培养以其生产周期短、培养物营养丰富以及便于收集加工等优点而越来越受到重视[5-6]。中药中含有纤维、糖类、生物碱等多种成分，有些成分可促进灵芝生长及活性物质的生产。笔者筛选出合适的中药加入灵芝深层发酵培养基中，研究铁皮石斛对灵芝生长及其主要活性次生代谢产物(多糖和灵芝酸)生产的影响。

1　材料与方法

1.1材料灵芝由温州大学生命与环境科学学院发酵工程研究室筛选保存。铁皮石斛(Dendrobiumcandidum)由植物组织培养法获得，60 ℃烘干，粉碎，过60目筛。

1.2发酵培养基葡萄糖 35 g/L，蛋白胨 3.5 g/L，MgSO40.75 g/L，KH2PO41.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，VB110 mg/L。

1.3接种和培养将培养基121 ℃灭菌30 min，冷却后接入灵芝液体种，接种量10%。摇瓶条件：250 mL三角瓶，装液量80 mL，温度30 ℃，转速150 r/min，培养时间5 d。

1.4测定项目与方法①生物量：采用重量法测定；②胞外多糖：采用硫酸-苯酚法测定；③还原糖：采用DNS法测定。

1.5多糖的分离提取及组分分析发酵液离心取上清液，减压浓缩至适当体积，加4倍体积95%乙醇沉淀，4 ℃冰箱中静置24 h。离心，沉淀用蒸馏水溶解，Sevag法脱蛋白，以KTA explorer 快速纯化系统进行多糖组分分析。色谱柱HiPrepTM16/10 DEAE，上样量2 mL，以H2O，0.05、0.20和0.50 mol/L NaCl 溶液梯度洗脱，流速2 mL/ min, 分步收集，每管5 mL，采用苯酚-硫酸法进行检测。

2　结果与分析

2.1铁皮石斛添加量对灵芝生长和胞外多糖分泌的影响在灵芝清液培养基中添加0、5、10、15、20 g/L铁皮石斛，考察其对灵芝生长及胞外多糖分泌的影响，结果见图1。由图1可知，铁皮石斛对灵芝生长有一定的抑制作用，加入量大(20 g/L)时较明显，但添加量在10 g/L范围内抑制作用不明显。在对胞外多糖分泌方面，加入10 g/L左右的铁皮石斛对灵芝胞外多糖的生产有促进作用。

图1　铁皮石斛添加量对灵芝生长和胞外多糖分泌的影响Fig.1　Effects of D.candidum quantity on the growth and polysaccharide produciton of G.lucidum

2.2铁皮石斛对灵芝发酵过程的影响在灵芝清液发酵培养基中加入10 g/L铁皮石斛，考察铁皮石斛对灵芝发酵过程的影响。加铁皮石斛与不加铁皮石斛(对照)情况下灵芝生长及胞外多糖分泌过程见图2。由图2可知，灵芝对铁皮石斛的存在有一个适应过程，前40 h生长缓慢，但在此过程中胞外多糖的分泌较对照迅速，其后灵芝的生长加速，在120 h时与对照接近。为此，将添加铁皮石斛的灵芝发酵延长其发酵时间24 h，其生物量可达对照水平。

图2　铁皮石斛对灵芝发酵过程的影响Fig.2　Effects of D.candidum on the fermentation process of G.lucidum

2.3含铁皮石斛基质发酵灵芝的多糖组分分析在灵芝发酵培养基中加入10 g/L铁皮石斛可以促进灵芝胞外多糖的生产，为考察铁皮石斛对灵芝胞外多糖组成的影响，对清液发酵灵芝液中的多糖(GLP)、含铁皮石斛基质发酵的灵芝液中的多糖(GDP)分别进行分离提取，并以Sevag法去除大部分蛋白，再以KTA explorer(离子交换柱)进行多糖组分分析。

表1DEAE分离洗脱各峰的胞外多糖含量

Table 1Exopolysaccharide content in each peak from the DEAE column

峰SampleGLP含量Contentmg占比Percentage%GDP含量Contentmg占比Percentage%PS13.7568.684.0565.85PS20.173.110.396.34PS30.8615.751.2019.51PS40.6812.450.518.29

3　结论

(1)铁皮石斛对灵芝的生长有一定的抑制作用，在添加量较小(10 g/L)时抑制作用不明显，但能刺激灵芝胞外多糖的合成。

图3　GLP在DEAE柱上经H2O，0.05、0.20、0.50 mol/L NaCl的洗脱曲线Fig.3　The chromatography profile of GLP on DEAE column eluted by H2O, 0.05, 0.20, and 0.50 mol/L NaCl

图4　GDP在DEAE柱上经H2O，0.05、0.20、0.50 mol/L NaCl的洗脱曲线Fig.4　The chromatography profile of GDP on DEAE column eluted by H2O, 0.05, 0.20, and 0.50 mol/L NaCl

[1] 张群豪，林志彬.灵芝多糖(GL- B)对肿瘤坏死因子α和γ干扰素产生及其mRNA表达的影响[J].北京医科大学学报，1999，31(2)：179-183.

[2] 赵东旭，杨新林，王帮武,等.灵芝研究的若干进展[J].食用菌学报，1999，6(3)：59-64.

[3] EL-MEKKAWY S，MESELHY M R，NAKAMURA N，et al.Anti-HIV-1 protease substances fromGanodermalucidum[J].Phytochem，1998，49(6)：1651-1657.

[4] MIN B S，GAO J J，NAKAMURA N，et al.Triterpenes from the spores ofGanodermalucidumand their cytotoxicity against Meth-A and LLC tumor cells[J].Chem Pharm Bull，2000，48(7)：1026-1033.

[5] 李平作.灵芝深层发酵生产生物活性物质的研究[D].无锡：无锡轻工大学，1997.

[6] 杨海龙，章克昌.以薏苡仁为基质的灵芝液体发酵：Ⅱ.主要活性成分分析[J].中国食品学报，2006,6(5)：105-110.

Effects ofDendrobiumcandidumon the Polysaccharide Fermentation ofGanodermalucidumby Submerged Culture

ZHENG Hao-ran1, YANG Hai-long2*

(1.Renji College, Wenzhou Medical University, Wenzhou, Zhejiang 325035; 2.School of Life and Environment Sciences, Wenzhou University, Wenzhou, Zhejiang 325035)

[Objective] To explore the effects ofDendrobiumcandidumon the growth ofGanodermalucidumandand its exo-polysaccharide production and analyze the changes of polysaccharide components.[Method]D.candidumwas added to the media, and the biomass and polysaccharide content ofG.lucidumwere analyzed.The polysaccharide components were analyzed by the column chromatography analysis of KTA explorer.[Result] The production of exopolysaccharide was enhanced byD.candidum, and 1% of addition amount was suitable.The components of exopolysaccharide were not changed byD.candidum.[Conclusion] It is helpful to enhance the polysaccharide production ofG.lucidumby the addition ofD.candidumin the submerged culture media.

Dendrobiumcandidum;Ganodermalucidum; Polysaccharide; Submerged culture

浙江省自然科学基金项目(Y3100711)。

郑浩然(1990- )，男，江西资溪人，本科生，专业：信息系统与信息管理。*通讯作者，教授，博士，从事发酵工程研究。

2016-05-16

S 567.3+1;TQ925

A

0517-6611(2016)19-141-02