固本防哮饮对信号转导及转录激活因子1及哮喘易感基因ORMDL3的影响*

董盈妹　王爱华　陆　远　凌　昊　刘亚南　赵　霞△（1.南京中医药大学中医儿科学研究所，江苏 南京 21002；2.江苏省儿童呼吸疾病（中医药）重点实验室，江苏 南京 21002；.江苏省宜兴市中医医院，江苏 宜兴 214200）



固本防哮饮对信号转导及转录激活因子1及哮喘易感基因ORMDL3的影响*

董盈妹1，2王爱华1，2陆远1，2凌昊3刘亚南1，2赵霞1，2△
（1.南京中医药大学中医儿科学研究所，江苏 南京 210023；2.江苏省儿童呼吸疾病（中医药）重点实验室，江苏 南京 210023；3.江苏省宜兴市中医医院，江苏 宜兴 214200）

目的 观察固本防哮饮对信号转导和转录因子1（STAT1）及哮喘易感基因血清类黏蛋白1样蛋白3 （ORMDL3）的调控作用，分析其防治哮喘机制。方法 利用白介素-4诱导人支气管上皮细胞建立哮喘细胞模型，固本防哮饮含药血清对其进行干预，采用实时荧光定量-PCR（Real Time PCR）、免疫印迹法（Western blotting，WB）、免疫荧光法（IF）分别从基因、蛋白水平检测细胞中ORMDL3和STAT1的表达及亚细胞定位。结果 与正常组比较，模型组ORMDL3、STAT1 mRNA含量升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），固本防哮饮可降低模型组细胞ORMDL3、STAT1 mRNA水平，差异无统计学意义（P＞0.05）；与正常组比较，模型组ORMDL3、STAT1蛋白表达显著增加（P＜0.05或P＜0.01），与模型组相比，固本防哮饮组ORMDL3及STAT1蛋白表达均显著（P＜0.05）。结论 固本防哮饮对STAT1及ORMDL3的表达有一定的调控作用，可能为固本防哮饮防治哮喘的内在机制。

固本防哮饮哮喘易感基因血清类黏蛋白1样蛋白3信号转导和转录因子1

【Abstract】Objective：To investigate the effect of Guben Fangxiao Decoction on STAT1 and asthma susceptibility gene ORMDL3，and analyze its mechanism.Methods：16HBE cells were cultured in the presence of the Th2 cytokines IL-4 for 24 hours，and then treated with Guben Fangxiao Decoction.Expressions of ORMDL3 and STAT1 were assessed by quantitative real-time PCR，Western Bloting and Immunofluorescence.Results：The expressions of ORMDL3 and STAT1 mRNA were increased after IL-4 stimulation，compared with normal 16HBE，but the differences had no statistical significance（P＞0.05）.Compared with the model group，Guben Fangxiao Decoction could decrease the expressions of ORMDL3 and STAT1 mRNA；the differences had no statistical significance（P＞0.05）.Compared with the normal group，expressions of ORMDL3 and STAT1 protein of the model group were obviously increased（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with the model group，Guben Fangxiao Decoction significantly decrease cell constitution of ORMDL3 and STAT1 protein（P＜0.05）.Conclusion：The prevention of Guben Fangxiao Decoction against asthma may be associated with regulation of STAT1 and ORMDL3.

【Key words】Guben Fangxiao Decoction；Asthma；Susceptibility gene；ORMDL3；STAT1

支气管哮喘是由遗传因素和环境因素共同作用的异质性呼吸系统疾病。据估算全球大约有3亿哮喘患者，且每年约有346000人死于哮喘［1］，第3次流行病学调查结果显示，我国主要城区儿童哮喘总患病率约为3.02%，2年现患率达2.32%，累积患病率、现患病率均呈上升趋势［2］，因此探索支气管的有效防治有重要意义。2007年，Moffatt MF等［3］通过对994例哮喘患儿，1243例非哮喘儿童DNA中317000个SNPs进行分析发现，血清类黏蛋白1样蛋白3（ORMDL3）与儿童哮喘密切相关，ORMDL3可被Th2型细胞因子 ［白介素（IL）-4或IL-13］激活并主要在气道上皮细胞上表达［4］。信号转导和转录因子1（STAT1）是哮喘的免疫调节中至关重要的调控因子。本研究应用IL-4刺激16HBE细胞模拟哮喘时细胞状态，旨在通过体外实验从基因、蛋白水平研究固本防哮饮对STAT1及哮喘易感基因ORMDL3的调控作用。现报告如下。

1　材料与方法

1.1药物与试剂人支气管上皮细胞（16HBE），购自上海博古生物科技有限公司，采用第4～10代对数分裂期细胞。IL-4（美国R&D，批号：AG301307）；兔抗ORMDL3多克隆抗体、羊抗兔IgG HRP二抗 （美国abcam公司）；羊抗ORMDL3多克隆抗体、鼠抗β-actin多克隆抗体、兔抗STAT1多克隆抗体、羊抗鼠IgG HRP二抗（美国Santa Cruz公司）；驴抗羊IgG（美国invitrogen公司）；引物（具体序列见表1，上海生工生物工程公司）

表1　Real time-PCR引物序列

1.2仪器蛋白印迹-多功能成像系统、半干式转膜仪、Western Blot电泳仪（美国Bio-Rad公司）；多功能酶标仪（Infinite M200PRO，瑞士TECAN公司）；蛋白核酸分析仪、PCR逆转录仪（德国eppendorf公司）；荧光定量PCR仪（型号：Quantstudio 7Flex，美国Life technologies公司）；激光共聚焦显微镜系统TCS SP5（德国Leica公司）。

1.3含药血清制备按9 g/kg固本防哮饮生药量、孟鲁司特钠1.0 mg/kg及等体积0.9%氯化钠注射液对家兔进行灌胃，每日2次，连续给药3 d。末次给药1 h后对家兔进行耳尖静脉麻醉后颈动脉采血，无菌离心取血清，过滤后-20℃保存备用［5］。

1.4细胞培养及造模16HBE细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640的T75培养瓶，置于37℃、5% CO2培养箱中。待生长状态良好的细胞接近铺满单层时以0.2%的胰酶消化传代，稀释细胞浓度至5×105/mL传入6孔板中 （免疫荧光时提前在6孔板中加入洁净盖玻片），待细胞长至60%（免疫荧光长至50%），换用含0.2%BSA的RPMI1640无血清同步化8 h。实验分组：正常对照组；模型组（0.1 g/L IL-4刺激24 h）［6］；固本防哮饮组、孟鲁司特钠组造模后分别予10%固本防哮饮、孟鲁司特钠含药血清干预24 h。

1.5免疫荧光检测PBS漂洗3次后，予预冷的4%多聚甲醛（PFA）固定30 min，0.1%Triton处理10 min，200 μL/孔含1%BSA封闭1 h，1%BSA稀释的目的蛋白一抗（1∶200）4℃冰箱过夜，PBS漂洗后加入含荧光标记的二抗（1∶1000）于避光湿盒中孵育1 h，PBS漂洗3次，DAPI染色3 min，漂洗后予荧光显微镜观察并拍照。

1.6Western blotting法检测RIPA∶PMSF=100∶1配制裂解液，200 μL/孔。4℃13000 r/min 30 min离心取上清，BCA法蛋白定量，30μg/孔进行凝胶电泳 （80 V 30 min；110 V 1 h），ORMDL3（5%积层胶，12%分离胶），STAT1（5%积层胶，8%分离胶），将SDS-PAGE凝胶蛋白转移至PVDF膜上，以5%脱脂奶粉室温封闭2 h、一抗（ORMDL3/STAT1 1∶500稀释、β-actin 1∶1000稀释）4℃孵育过夜、二抗（1∶5000稀释）室温孵育2 h，过程中均以1×TBST漂洗3次，每次10 min。加ECL化学发光法显影，蛋白印迹-多功能成像系统、Image Lab软件拍照并扫描各条带的灰度值，结果分析以ORMDL3或STAT1与内参β-actin灰度值比值表示。

1.7Real-time PCR法检测1 mL Trizol/孔提取各组细胞总RNA，按TAKARA逆转录试剂盒说明将总RNA逆转录为cDNA，按20 μL体系（SYBR 10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，ROXⅡ0.4 μL，DEPC 6μL）加入96孔板内，2步法进行Real-time PCR检测，反应条件为，第1步：95℃ 30 s，第2步：95℃5 s，60℃30～34 s；重复40个循环。Real-time PCR结果以内参基因β-actin进行校准，以2-ΔΔCT表示。

1.8统计学处理应用SPSS19.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法，当方差不齐时，采用T检验进行配对比较检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1固本防哮饮对哮喘易感基因ORMDL3的影响

2.1.1免疫荧光结果见图1，表2。ORMDL3蛋白主要表达于细胞质中，与正常组比较，模型组细胞ORMDL3调控的蛋白荧光强度显著升高（P＜0.01），与模型组比较，固本防哮饮及孟鲁司特钠含药血清干预后，细胞内ORMDL3蛋白荧光强度显著减弱 （P＜0.05或P＜0.01）。

图1　免疫荧光检测各组细胞ORMDL3表达水平

2.1.2Western blotting检测结果见图2，表3。结果显示，与正常组比较，模型组细胞中ORMDL3蛋白的表达显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，固本防哮饮、孟鲁司特钠含药血清干预后ORMDL3蛋白表达量减少（P＜0.05或者P＜0.01），提示固本防哮饮能够下调模型组细胞ORMDL3蛋白的高表达状态。

表2　各组细胞ORMDL3蛋白荧光值比较（±s）

表2　各组细胞ORMDL3蛋白荧光值比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

组别　n ORMDL3荧光值正常组　3模型组　3固本防哮饮组　3 4.3500±1.04130**30.6600±2.01487 16.5033±3.88402**孟鲁司特钠组　311.1133±3.05197**

图2　各组细胞ORMDL3蛋白表达

表3　各组细胞ORMDL3蛋白灰度比值比较（±s）

表3　各组细胞ORMDL3蛋白灰度比值比较（±s）

组别　n ORMDL3/β-actin比值正常组　3模型组　3固本防哮饮组　3 1.0110±0.22407*1.5277±0.22547 1.0001±0.09545*孟鲁司特钠组　30.9253±0.21231**

2.1.3Real-time PCR检测结果见表4。模型组细胞ORMDL3 mRNA较正常组升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），固本防哮饮、孟鲁司特钠组细胞ORMDL3 mRNA水平较模型组降低，无显著意义（P＞0.05），提示固本防哮饮可能对ORMDL3 mRNA高表达状态有调控作用。

表4　各组细胞ORMDL3 mRNA转录水平比较（±s）

表4　各组细胞ORMDL3 mRNA转录水平比较（±s）

组别　n 2-△△CT正常组　3模型组　3固本防哮饮组　3 1.2153±0.23247 1.2493±0.25064 1.0617±0.23953孟鲁司特钠组　30.8607±0.06401

2.2固本防哮饮对STAT1的影响

2.2.1免疫荧光结果见图3，表5。图片显示，STAT1蛋白可在细胞质及细胞核内表达，IL-4刺激后STAT1胞核内表达增加，与正常组比较，模型组细胞内STAT1蛋白荧光表达显著升高（P＜0.05），与模型组比较，固本防哮饮组及孟鲁司特钠组细胞内STAT1蛋白荧光水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05），提示固本防哮饮能够下调模型组细胞ORMDL3蛋白的高表达状态。

图3　免疫荧光检测各组细胞STAT1表达水平

表5　各组细胞STAT1荧光值比较（±s）

表5　各组细胞STAT1荧光值比较（±s）

组别　n ORMDL3荧光值正常组　3模型组　3固本防哮饮组　3 4.7200±1.63789 23.8567±3.08455△14.3233±0.97577*孟鲁司特钠组　317.7100±1.29626*

2.2.2Western blotting检测结果见图4，表6。与正常组比较，模型组细胞STAT1蛋白水平显著升高（P＜0.01），与模型组比较，固本防哮饮组、孟鲁司特钠组较模型组STAT1蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），提示固本防哮饮可下调16HBE细胞STAT1蛋白的高表达状态。

图4　各组细胞STAT1蛋白表达

表6　各组细胞STAT1蛋白灰度比值比较（±s）

表6　各组细胞STAT1蛋白灰度比值比较（±s）

组别　n ORMDL3/β-actin比值正常组　3模型组　3固本防哮饮组　3 1.2898±0.14065**1.9300±0.14591 1.3943±0.31701*孟鲁司特钠组　31.4715±0.13450*

2.2.3Real-time PCR检测结果见表7。模型组细胞STAT1 mRNA较正常组升高，但无显著差异（P＞0.05），固本防哮饮、孟鲁司特钠组能够降低模型组细胞STAT1mRNA水平，但无显著差异（P＞0.05），提示固本防哮饮可能对STAT1 mRNA高表达状态有调控作用。

表7　各组细胞STAT1 mRNA转录水平比较（±s）

表7　各组细胞STAT1 mRNA转录水平比较（±s）

组别　n 2-ΔΔCT正常组　3模型组　3固本防哮饮组　3 1.4960±0.60880 1.7583±0.80276 1.5670±0.75196孟鲁司特钠组　31.0037±0.11433

3　讨　论

《王旭高医案》云“痰恋不化，气机阻滞，一触风寒，喘即举发”。中医理论认为，肺为储痰之器，脾为生痰之源，小儿脏腑娇嫩、正气未充或因先天禀赋不足，胶痼之痰伏于肺中，外邪引动，哮喘随之发作。固本防哮饮为国家名老中医江育仁先生的经验方，具补肺固表，健脾化痰的功效。通过调理哮喘缓解期患儿脏腑功能，消除内伏“风痰夙根”，可达治病求本的功效。一项随机对照临床试验［7］表明固本防哮饮联合穴位敷贴可显著减少患儿哮喘发作次数，较普米克都保吸入更能显著减轻哮喘发作的严重程度。

ORMDL3基因位于17q21位点，国内一项大规模Meta分析［8］显示ORMDL3基因rs72l6389多态性是中国人成人和儿童哮喘发病的危险因素。其他研究表明ORMDL 3与EB病毒及人鼻病毒（HRV）等呼吸道感染有关［3，9］。其可能机制为以下2个方面。1）通过抑制内质网钙泵（SERCA），ORMDL3加重内质网未折叠蛋白反应，修饰T细胞活化的关键步骤，为哮喘发生的内源性诱因［3］。如有文献［10］表明，以ER诱导物引起UPR在ORMDL3基因敲除细胞及正常细胞中表达并没有显著差异。2）ORMDL3蛋白与丝氨酸棕榈转移酶（SPT）形成稳定复合物抑制鞘类脂质代谢，病理情况下，ORMDL 3蛋白磷酸化减少复合物的形成，下调ORMDL 3对鞘类脂质合成的抑制作用。然而Kiefer K等实验证明ORMDLs确实可抑制SPT的活化，但单个ORMDLs的表达增加并没有减少细胞内神经酰胺的含量，这与ORMDL3 SNPs与合成途径完全抑制所致的细胞鞘脂类含量有关的观点相冲突［11］。因此鞘脂类代谢可能参与ORMDL3诱发哮喘机制，但是二者关系较为复杂，需进一步探索。STAT1是连接多种细胞膜受体与选择性效应器之间信号转导的主要蛋白质，细胞因子 IL-4、IFN-γ等可通过 JAK/STAT途径激活STAT1而诱导目的基因表达。Tetsuya Homma等利用病毒产物dsRNA及炎症因子协同刺激气道上皮细胞研究表明TNF-α、IFN-γ及dsRNA在哮喘中的作用均可能依赖STAT1而产生［12］。此外，O′Connell D等研究显示，IFN-γ可通过JAK/STAT信号通路降低呼吸道上皮细胞对糖皮质激素的敏感性，同时siRNA-STAT1转染可恢复细胞内类固醇的应答反应，提示通过抑制STAT1作用可提高吸入性糖皮质激素对严重型哮喘的治疗效果［13］。由此可见STAT1及易感基因ORMDL3均与哮喘关系密切，但目前尚无二者相关的国内外文献依据。

前期体内实验研究表明固本防哮饮可显著改善哮喘小鼠气道炎症，下调哮喘模型小鼠肺组织STAT1及ORMDL3的表达［14-15］。本体外实验结果显示，固本防哮饮组STAT1及ORMDL3 mRNA及蛋白表达均较模型组降低，尽管mRNA差异无显著统计学意义，其可能原因与在基因的转录、翻译及翻译后修饰过程中存在多种调控机制以及实验误差有关。由此推断固本防哮饮对STAT1及ORMDL3的表达有一定的调控作用，可能为固本防哮饮防治哮喘的内在机制，但STAT1与ORMDL3的表达是否相关仍需要进行通路阻滞等实验进一步验证。本课题组接下来将通过构建ORMDL3质粒，通过质粒转染的方法进一步探索固本防哮饮对易感基因的调控机制，为中药复方防治哮喘的临床应用及推广提供科学依据。

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Influence of Guben Fangxiao Decoction on Expressions of STAT1 and Asthma Susceptibility Gene ORMDL3 in Vitro

DONG Yingmei，WANG Aihua，LU Yuan，et al.Institute of Pediatrics of Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210023，China.

R256.12

A

1004-745X（2016）05-0762-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.004

国家自然科学基金项目（81173299；81473723）
△

（电子邮箱：zhaoxiahy@126.com）

2015-12-29）