黔东南州产青钱柳黄酮类成分的含量测定研究

谭　霖，杨　鑫，龙　滢，徐秋萍

(黔东南州食品药品检验检测中心，贵州　凯里　556000)



黔东南州产青钱柳黄酮类成分的含量测定研究

谭霖，杨鑫，龙滢，徐秋萍

(黔东南州食品药品检验检测中心，贵州凯里556000)

建立高效液相色谱法测定青钱柳中槲皮素、山柰素的含量，并测定黔东南州不同产地青钱柳中槲皮素、山柰素的含量。高效液相色谱法，色谱柱Symmetry C18(5 μm，150×4.6 mm，Waters)；流动相：甲醇-0.4 %磷酸溶液(50；50)；检测波长：360 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μl。经实验得知黔东南州不同产区的青钱柳中槲皮素、山柰素含量存在一定的差异，槲皮素的含量范围大概为0.663 2～0.814 7 mg / g；山柰素的含量范围大概为0.587 1～0.715 5 mg / g。

青钱柳，槲皮素，山柰素，高效液相色谱仪

钱柳[Cyclocarpaliurus(Batal.)Iljinskaja]又名青钱李、摇钱树等，双子叶植物纲[Dicotyledneae]胡桃科[juglangdaceae]青钱柳属植物。广泛分布于江西、浙江、江苏、福建、台湾、湖北、四川、贵州等地的海拔420～2 500 m的山区、溪谷或石灰岩山地。青钱柳为落叶大乔木，高10～30 m，髓部薄片状；奇数羽状复叶，小叶7～9枚。革质椭圆形，上面有盾状腺体，下面网脉明显，边缘有细锯齿；树皮灰色，枝条黑褐色，具灰黄色皮孔：芽密被锈褐色盾状着生的腺体。雌雄同株，雄柔荑花序2～4条成一束集生在短总梗上，雌柔荑花序单独顶生。果序轴长25～30 cm，上有一串串的果实，果实革质有水平圆盘状翅，顶端有4枚宿存花被片及花柱，似铜钱，具观赏价值。花期4-5月，果期7-9月。根系比较发达，主侧根多分布于40～80 cm的土层中[1]。长期以来，民间采其嫩叶制茶实用，该茶具有生津止渴、清热解暑、降压强心及延年益寿的作用，具有调节血脂，降低血糖，增强免疫等功能，抗氧化防衰老的作用[2]。研究表明：其中含有丰富的药用成分，如多糖、黄酮、酚类、植物蛋白(小肽)、皂苷、香豆精、生物碱、甾体、萜类、苷类、有机酸、胡萝卜素、维生素E、咖啡因等和一些人体必需的微量元素。黄酮类成分为青钱柳中报道较多的一类化学成分，主要有槲皮素、异槲皮苷、山奈酚、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖、山奈酚-3-O-β-D吡喃葡萄醛酸苷槲、皮素-3-氧-α-L-鼠李糖苷等[3]。本实验通过建立HPLC法测定黔东南州不同产地青钱柳槲皮素、山柰素的含量，研究得出黔东南州地区产青钱柳槲皮素、山柰素的含量范围，为青钱柳的进一步研究提供了一定的参考依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

仪器：UItimate3000(DGLC)Chromeleon HPLC仪(赛默飞科技(中国)有限公司)、色谱柱SymmetryC18(5 μm，150×4.6 mm，Waters公司生产)、EA-240电子天平(梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司)、KQ-500DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司；工作频率：40 kHz，功率：250 W)、XMTD-240数显式电热恒温水浴锅(常州市诺基仪器有限公司)、SHZ-D(III)循环水式真空泵(常州普天仪器制造有限公司)等。

试剂：盐酸(分析纯)、甲醇(色谱纯、分析纯)、磷酸(分析纯)；水为哇哈哈纯净水。

对照品：槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号100081-200406)、山柰素对照品(中国药品生物制品检定所提供， 110861-201209)。

供试品：黔东南州剑河县产2批(剑河1、剑河2)、雷山县产2批(雷山1、雷山2)、施秉县产2批(施秉1、施秉2)，共6个批次。

1.2试验方法

1.2.1提取溶剂的考察

根据青钱柳槲皮素、山柰素的理化性质，分别选取甲醇、25 %盐酸溶液—甲醇(1∶6)作为提取溶剂，考察最佳提取溶剂。分别取本品粉末约1.0 g(过3号筛)各平行2份共4份，其余按1.4项进行测定，每份平行进两针。平均含量结果见表1。

表1　不同提取溶剂的平均含量Tab.1　the average content of different extraction solvents

通过表1结果表明用甲醇提取槲皮素、山柰素的平均含量最高且溶剂方便直接取用不需要配制。故选择25 %盐酸溶液—甲醇(1∶6)作为提取溶剂。

1.2.2提取时间的考察

分别取本品粉末约1.0 g(过3号筛)各平行2份共6份，精密称定，并加25 %盐酸溶液—甲醇(1∶6)的混合溶液40 mL，分别置于80 ℃水浴加热回流20 min、30 min、40 min，取出，并都迅速冷却至室温；转移至50 mL量瓶中，用甲醇5 mL洗涤回流瓶，洗液并入同一量瓶中并加入甲醇稀释至刻度；摇匀；滤过；取续滤液；过0.45 μL微孔滤膜，即得。其余按1.4项进行测定，每份平行进两针。平均含量结果见表2。

表2　不同提取时间的平均含量Tab.2　The average content of different extraction time

上述结果表明，随着回流时间的增加，槲皮素、山柰素的提取量也逐渐增加，但是80 ℃水浴回流30 min和40 min的含量差异不大，所以选择80 ℃水浴回流30 min。

1.3色谱条件的优化

1.3.1流动相的优化

根据资料显示，槲皮素、山柰素的HPLC含量测定的流动相一般有：甲醇-0.4 %磷酸溶液(60∶40)；甲醇-0.4 %磷酸溶液(50∶50)；甲醇-0.4 %磷酸溶液(43∶57)。经过研究者在自身拥有的条件下研究摸索：流动相为甲醇-0.4 %磷酸溶液(60∶40)时槲皮素、山柰素目标峰的保留时间过短，出峰时间过早，均在10 min以内；流动相为甲醇-0.4 %磷酸溶液(43∶57)时槲皮素、山柰素目标峰的保留时间又太过于长，出峰时间太晚在20 min之后了。故选择尝试做流动相为甲醇-0.4 %磷酸溶液(50∶50)，其余按1.4项进行测定(图1)。

图1　流动相为甲醇-0.4 %磷酸溶液(50∶50)Fig.1　mobile phase of methanol to 0.4 % phosphoric acid solution(50∶50)

由色谱图得出：槲皮素、山柰素目标峰的保留时间适中，出峰时间在15 min以内，分离效果好。故选择流动相为甲醇-0.4 %磷酸溶液(50∶50)为最佳流动相。

为了检测前后峰的名称，故选择按“1.4色谱条件”进样10 μL，对槲皮素对照品进行定位，见图2。

图2　槲皮素定位图Fig.2　quercetin location map

由色谱图可以得出第一个峰为槲皮素，第二个峰为山柰素。

1.3.2检测波长的确定

根据查阅资料文献显示，槲皮素、山柰素在360 nm处有最大吸收，故确定检测波长为360 nm[4]。

1.4色谱条件及溶液制备

1.4.1色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4 %磷酸溶液(50∶50)为流动相；流速1.0 mL·min-1；检测波长为360 nm；柱温30 ℃；理论板数按槲皮素、山柰素峰计算应不低于2 500。

1.4.2对照品溶液的制备

取干燥至恒重的槲皮素对照品0.010 01 g(97.3 %)、山柰素0.010 22 g(93.2 %)，分别于25 mL量瓶中定容至刻度，摇匀，得0.389 6 mg / mL的原槲皮素对照品溶液、0.381 0 mg / mL原山柰素对照品溶液。再分别取1.0 mL的原槲皮素对照品溶液及原山柰素对照品溶液，于同一25 mL的量瓶中定容至刻度，摇匀，得到含槲皮素15.584 μg / mL及含山柰素15.24 μg / mL的混合对照品溶液。

1.4.3供试品溶液的制备

取本品粉末约1.0 g(过3号筛)，精密称定，加25 %盐酸溶液—甲醇(1∶6)的混合溶液40 mL，置于80 ℃水浴上加热回流30 min，取出，迅速冷却至室温；转移至50 mL量瓶中，用甲醇5 mL洗涤回流瓶，洗液并入同一量瓶中并加入甲醇稀释至刻度；摇匀；滤过；取续滤液；过0.45 μL微孔滤膜，即得供试品溶液。

1.4.4测定法

分别精密吸取上述对照品溶液及供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算槲皮素、山柰素的含量。

2　分析方法验证

2.1线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL，按1.4项色谱条件进行测定，每份平行进两针。注入液相色谱仪，记录色谱图，并以混合对照品进样质量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归计算。槲皮素线性回归方程为：y= 63.226x+0.005 27，相关系数r=0.999 86；线性关系考察结果、标准曲线见图3。山柰素线性回归方程为：y=66.168x-0.028 83，相关系数r=0.999 94；线性关系考察结果、标准曲线见图4。

图3　槲皮素标准曲线Fig.3　quercetin standard curve

图4　山柰素标准曲线Fig.4　kaempferia galanga standard curve

由上述测定结果表明槲皮素进样量在0.028 9～0.173 4 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系；山柰素进样量在0.029 9～0.179 4 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2精密度试验

取混合对照品溶液，按1.4项色谱条件进行测定，重复进样6次，测定峰面积，以峰面积计算RSD(%)。样品色谱图及测定结果分别见图5及表3。

图5　青钱柳样品色谱图Fig.5　samples of cyclocarya paliurus chromatograms

由色谱图可看出样品中含有山柰素和槲皮素。

表3　精密度试验Tab.3　precision test

从表中可看出槲皮素和山奈素的精密度(RSD)均小于2.0 %，结果表明，本方法精密度好。

2.3重复性实验

精密称取剑河地区青钱柳(剑河1)粉末(过3号筛)，平行制备6份，按1.4项色谱条件进行测定，RSD以平均含量计算，槲皮素RSD =1.1 %，山柰素RSD =0.58 %。测定结果见表4。

表4　重复性实验Tab.4　repetitive experiments

由表4可知该方法的重现性良好。

2.4稳定性试验

取重复性实验中的第一份供试液于0、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h时间点，按1.4项色谱条件测定槲皮素、山柰素峰面积，进行RSD以平均含量计算。槲皮素平均峰面积值为9.194 2 ，RSD为1.3 %；山柰素平均峰面积值为7.472 4，RSD为1.3 %。结果见表5。

表5　稳定性试验Tab.5　stability test

由上述测定结果表明，供试品溶液在24 h内比较稳定。

3　不同产地样品的测定

精密称取黔东南州3个不同产地的6批青钱柳样品约1.0 g(过3号筛)，按1.4项色谱条件进行测定。色谱叠加图及测定结果分别见图6和表6。

图6　六种不同批次样品色谱叠加图Fig.6　six different batches sample chromatographic overlay chart 表6　样品测定结果 Tab.6　samples determination results

样品批号称样量/g槲皮素含量/(mg/g)山柰素含量/(mg/g)剑河11.00040.66320.5871剑河21.00080.66820.5831雷山11.00030.73460.6415雷山21.00090.72410.6393施秉11.00040.81470.7155施秉21.00130.80960.7049

4　结果与讨论

通过对黔东南州3个不同产地6个不同批次的青钱柳中槲皮素、山柰素进行含量测定；结果表明，黔东南州地区青钱柳中槲皮素的含量范围大概为0.663 2 mg / g～0.814 7 mg / g；山柰素的含量范围大概为0.587 1 mg / g～0.715 5 mg / g。其中，同一产地的不同批次的青钱柳中槲皮素、山柰素含量均有细小的差异，不同产地间青钱柳中槲皮素、山柰素含量存在着较为明显的差异。因此为保证质量应注意产地和批次。本次没有对样品的生长环境、干燥方法和具体采收时间进行考察，这几个因素对样品的质量有一定的影响。

【REFERENCES】

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Determination of the content of flavonoids inCyclocaryapaliurusgrown in Qiandongnan

TAN Lin，YANG Xin，LONG Ying，XU Qiuping

(QiandongnanFoodandDrugInspectionandTestingCenter，Kaili556000，China)

In this study，we developed a method for the determination of the content of quercetin and kaempferol in Cyclocarya paliurus by HPLC，and determined the content of quercetin and kaempferol in Cyclocarya paliurus grown in different places in Qiandongnan.The experimental scheme was as follows：chromatography column Symmetry C18(5 um，150×4.6 mm，Waters)，methanol / 0.4 % phosphoric acid solution(50，50)as mobile phase，detection wavelength of 360 nm，column temperature at 30 ℃，flow rate at 1.0mL·min-1，sample volume of 10 μl.The results showed that the content of quercetin and kaempferol in Cyclocarya paliurus grown in different places were different.The content of quercetin was within the range of 0.663 2～0.814 7 mg / g，and the content of kaempferol was within the range of 0.587 1～0.715 5 mg / g.

Cyclocaryapaliurus，quercetin，kaempferol，high performance liquid chromatograph

R284.1

A

1003-6563(2016)04-0077-05

2014-04-13；

2016-04-18

谭霖，男，苗族，贵州省天柱县人，本科，就职于黔东南州食品药品检验检测中心，研究领域：中药学，研究方向：中药材质量。