养阴活血方药对糖尿病大鼠肾皮质氧化应激损伤的保护作用

梁金环，赵利娜，崔云鹏沧州医学高等专科学校，河北沧州061001



养阴活血方药对糖尿病大鼠肾皮质氧化应激损伤的保护作用

梁金环，赵利娜，崔云鹏
沧州医学高等专科学校，河北沧州061001

目的：通过观察养阴活血方药对糖尿病（DM）大鼠肾皮质一氧化氮合酶（NOS）及过氧亚硝基（ONOO-）水平的影响，探讨养阴活血方药对糖尿病大鼠肾皮质氧化应激损伤的保护作用。方法：将16只SD大鼠采用链脲佐菌素（STZ）复制糖尿病大鼠模型造模，造模成功后，随机分为糖尿病对照组（DM组，n=8）和养阴活血方药组（NYPBR组，n=8），另设8只健康SD大鼠为正常对照组（NC组）。NYPBR组给予养阴活血方药干预。至10周末，检测各组大鼠肾皮质丙二醛（MDA）含量及超氧化物岐化酶（SOD）、总NOS（TNOS）、诱导型NOS（iNOS）和固有型NOS（cNOS）的活性，免疫组化检测肾皮质ONOO-特异性标志物硝基酪氨酸（NT）的生成，检测各组大鼠血糖、体质量、肾质量、24小时尿蛋白及血肌酐。结果：与NC组相比，DM组大鼠肾皮质MDA［（1.78±0.16）nmol/mgprot］水平升高（P＜0.05），SOD［（68.96±3.82）U/mgprot］活性下降，TNOS（3.44±0.30）U/mgprot与iNOS（2.54±0.21）U/mgprot活性显著升高，NT［（42.66±3.14）］生成明显增加，肾质量/体质量、24小时尿蛋白、血肌酐水平显著升高。上述指标2组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。干预后，BYPBR组肾质量/体质量、24小时尿蛋白、血肌酐较DM组均有明显改善，MDA［（1.56±0.08）nmol/mgprot］下降，SOD［（76.44±4.90）U/mgprot］升高，i-NOS［（2.54±0.21）U/mgprot］活性和NT（26.19±1.58）生成均显著降低，上述指标组内比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。cNOS 3组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：NYPBR可显著减轻糖尿病大鼠肾皮质氧化应激损伤，此作用可能与提高SOD活性，降低iNOS活性及ONOO-的生成有关。

糖尿病肾病；氧化应激；诱导型一氧化氮合酶；过氧亚硝基；养阴活血方药

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病全身微血管病变的肾脏特征表现，是导致糖尿病患者慢性肾衰竭的最主要原因。DN的发病机制较为复杂，随着对DN研究的不断深入，氧化应激被认为是DN发生、发展的中心环节［1］。ONOO-由超氧阴离子（O2-）氧化NO生成，是目前已知氧化性最强的一类物质［2］。糖尿病高糖状态下，异常生成的NO和ONOO-引发的氧化应激损伤可能参与糖尿病肾病的发生与发展。中医学认为消渴病以阴虚为本，并有消渴必瘀，瘀可致消的说法，以此病机为治则，笔者确立养阴活血方药对糖尿病大鼠进行防治［1］，旨在探讨养阴活血方药对糖尿病大鼠肾皮质氧化应激损伤的保护作用及其与NOS、ONOO-的关系。

1　材料与方法

1.1材料链脲佐菌素（STZ Sigma公司生产，批号067K1403），肌酐、尿蛋白定量、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒及MDA、SOD和NOS（分型）测试盒均购自南京建成生物工程研究所，鼠抗鼠NT单克隆抗体（Cayman公司提供，批号125210），养阴活血方药以六味地黄丸为基本方加减而成，包括熟地黄20 g，牡丹皮20 g，山药15 g，山萸肉10 g等六味中药，常规水煎成1 000 g/L生药浓度药液［1］。

1.2模型建立及分组健康雄性SD大鼠24只（河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证编号：809091），4月龄，体质量250～300 g。16只大鼠腹腔注射STZ溶液制备糖尿病模型，注射后3天取尾静脉血测血糖，血糖≥16.7 mmol/L，且能维持1周以上，确定糖尿病模型。成模大鼠随机分为：糖尿病对照组（DM组，n=8只）和养阴活血方药组（NYPBR组，n=8只）。同批次8只健康SD大鼠作为正常对照组（NC组），给予等体积柠檬酸钠缓冲液注射。NYPBR组按人和动物间体表面积折算的等效剂量灌喂给药（含生药1 g/mg），每只大鼠3 mL/d。实验期间所有大鼠均正常饲料喂养，自由饮水。

1.3样本采集造模成功10周结束，收集各组大鼠24小时尿液，称取体质量，检测血糖；股动脉放血，收集血标本，分离肾脏并称质量，计算肾肥大指数；取部分肾皮质4%多聚甲醛溶液中固定，用于免疫组织化学检测；其余肾皮质液氮保存。

1.4实验检测取尾静脉血，检测成模及10周末时的血糖变化。按试剂盒操作说明测定血肌酐、24小时尿蛋白。取肾皮质，称质量，用预冷生理盐水制备10%的组织匀浆，低温离心，取上清液；测定匀浆液MDA、SOD、TNOS、诱导型NOS（iNOS）及组成型NOS（cNOS），考马斯亮蓝法测定组织蛋白含量，均严格按照试剂盒说明书操作。采用免疫组织化学法检测NT的生成：石蜡切片常规脱蜡，3%H2O2处理，滴加鼠抗鼠NT单克隆抗体，滴加二抗（羊抗鼠），再滴加HRP标记的链霉卵白素工作液，联苯胺（DAB）显色，脱水封片，显微镜下观察，并分析NT表达相对强度。

1.5统计学方法采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据采用（±s）表示，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1一般情况10周病程结束时，与NC组比较，DM组大鼠血糖显著升高，2组比较差异有统计学意义（P＜0.05），肾脏肥大指数增大，2组比较差异有统计学意义（P＜0.05），Scr和24小时尿蛋白均显著增高，2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；与DM组相比，NYPBR组血糖较低，但差异无统计学意义（P＞0.05），Scr和24小时尿蛋白定量均显著降低（P＜0.05），肾脏肥大指数无明显变化（P＞0.05）。见表1。

表1　各组大鼠血糖、肾重/体质量、24 h尿蛋白及血肌酐的变化s）

表1　各组大鼠血糖、肾重/体质量、24 h尿蛋白及血肌酐的变化s）

注：与NC组比较，**表示P＜0.01；与DM组比较，▲▲表示P＜0.01。

组别只数血糖/（mmol·L-1）肾重/体质量（×10-3）24小时尿蛋白/mgScr/（μmol·L-1）NC DM NYPBR 888 5.26±0.43 26.38±1.11**25.42±0.79 2.91±0.13 5.70±0.29**5.33±0.33 7.68±0.551 148.91±14.84**79.19±8.40▲▲22.78±9.76 261.68±34.37**197.22±19.02▲▲

2.2肾皮质M D A、SO D与NC组比较，DM组MDA水平升高，2组比较差异有统计学意义（P＜0.05），SOD活性显著降低，2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；与DM组相比，NYPBR组MDA水平下降（P＜0.05），SOD活性升高，2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2　各组大鼠肾皮质M D A、SO D的变化（χ±s）

表2　各组大鼠肾皮质M D A、SO D的变化（χ±s）

注：与NC组比较，**表示P＜0.01；与DM组比较，▲表示P＜0.05。

2.3肾皮质TN O S、i N O S、及cN O S与NC组比较，DM组TNOS、iNOS活性均显著升高，2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；cNOS活性高于正常对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与DM组相比，NYPBR组TNOS、iNOS活性均显著降低，2组比较差异有统计学意义（P＜0.05），cNOS活性无明显变化，2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

2.4肾皮质N T免疫组化NC组染色呈灰蓝色，未检出NT生成，DM组NT免疫组化染色呈黄褐色，阳性信号主要定位于肾小球，NYPBR组染色强度弱于DM组，NT生成量显著降低（P＜0.05）。见表3。

表3　各组大鼠肾皮质TNOS、iNOS、cNOS活性及NT含量变化

3　讨论

随着糖尿病发病率逐年提高，DN已成为导致慢性肾功能衰竭的主要原因［2］。多种复杂机制介导了DN的发生，氧化应激被认为是重要的共同机制。活性氧簇（ROS）中ONOO-及其衍生物氧化能力较H2O2强约2 000倍，是氧化性最强的一类，构成了氧化应激新的物质基础。

大量实验显示，DM早期NO合成和活性增加，随着DM的进展，NO生物学活性降低［3］。但有研究表明NO的合成量并没有减少［4］。在实验中，DM组大鼠肾皮质脂质过氧化标志物-MDA含量升高，清除O2-的SOD活性下降，TNOS显著增强，表明糖尿病大鼠肾皮质处于明显的氧化应激状态。随着TNOS的升高，iNOS升高显著，但cNOS变化不明显，表明TNOS活性增强主要是由iNOS活性升高引起。

本实验NT免疫组化检测结果显示，DM组大鼠肾实质NT染色强度最大，主要分布在肾小球，肾小管也见染色，各组大鼠NT的生成量与其iNOS活性变化及肾功能紊乱状态相平行，表明ONOO-引发的氧化应激损伤在DN的发病机制中发挥了重要作用［5］。

糖尿病肾病属中医“消渴”病之“下消”范畴，其病机主要在于肾阴亏虚，肾失固摄，病程日久，阴损及阳，可致阴阳俱虚，肾气衰败，五脏损极，浊毒壅塞三焦，升降失常，而成危候，最终出现病名为糖尿病肾病的一系列病理变化。本研究药物六味地黄丸三阴并补而重在补肾阴之意，六药并用，共收养阴活血之功。本实验中，NYPBR组大鼠肾皮质MDA水平下降，iNOS活性及NT生成量明显降低，而SOD活性升高，尿蛋白、血肌酐降低，表明NYPBR增强了机体的抗氧化能力，对肾功能紊乱有不同程度的改善。

综上所述，DM大鼠模型建立10周后，肾皮质iNOS活性增强，NT生成增加，与肾功能改变相一致，表明iNOS过度激活导致肾皮质ONOO-大量生成引发的细胞毒性作用可能是造成DM肾脏损伤的重要机制之一。NYPBR可能是通过抑制iNOS的活性、提高SOD水平，进而降低ONOO-造成的氧化应激损伤，延缓或减轻DN的病理进程。目前已有单味山萸肉、熟地黄等应用于DN治疗的实验研究［6-7］，但具体机制，尚有待进一步研究。

［1］齐锦生，李恩，薛智权，等.滋阴补肾方药对糖尿病大鼠骨中一氧化氮合酶mRNA表达的影响［J］.中医杂志，2003，44（5）：379-381.

［2］谢席胜，艾娜，王宝福，等.糖尿病肾病流行病学研究进展［J］.中国中西医结合肾病杂志，2013，14（10）：937-939.

［3］金智生，陈雪，李甜.金匮肾气丸对实验性2型糖尿病肾病大鼠肾脏组织NO、NOS的影响［J］.中医药学报，2012，40（1）：56-59.

［4］潘振宇.氨基胍对糖尿病大鼠肾损害的治疗作用［J］.中国实用医药，2009，4（6）：4-6.

［5］廖琳，陈青，李国安，等.一氧化氮和一氧化氮合酶基因多态性与糖尿病肾病［J］.国外医学内科学分册，2005，32（10）：436-439.

［6］史云菊，张红艳，张德甫，等.山茱萸对2型糖尿病患者血糖和体质量的影响［J］.中医研究，2014，27（8）：23-24.

［7］吴金环，顾红岩，喇孝瑾，等.地黄与熟地黄对糖尿病小鼠血糖血脂的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2014，17（8）：161-163.

Protection of Nourishing Yin and Promoting Blood Circulation Recipe on the Oxidative Stress Injuries in Renal Cortex of Diabetic Rats

LIANG Jinhuan，ZHAO Li'na，CUI Yunpeng
Cangzhou Medical College，Cangzhou 061001，China

Objective：To investigate the protection of nourishing Yin and promoting blood circulation recipe（NYPBR）on the oxidative stress injuries in renal cortex of diabetic rats through observing the effect of nourishing Yin and promoting blood circulation recipe on the level of nitric oxide synthase（NOS）and peroxynitrite（ONOO-）in renal cortex of diabetic rats.Methods：Sixteen SD rat models were replicated by streptozotocin（STZ）and divided into diabetes control group（DM group，n=8），nourishing Yin and promoting blood circulation recipe group（NYPBR group，n=8）and normal control group（NC group）with eight healthy rats at random.The NYPBR group was treated with NYPBR.By the end of the tenth week，the content of renal cortices malondiadehyde（MDA），the activity of superoxide dismutase（SOD），total NOS（TNOS），inducible NOS（iNOS）and constitutive NOS（cNOS）were measured，the generation of nitrotyrosine（NT）as the specific marker of renal cortex ONOO-was detected by immunohistochemical method，blood sugar，body weight，kidney weight，24-hour urine protein and serum creatinine（SCr）were determined in three groups.Results：Compared with NC group，renal cortex MDA［（1.78±0.16）nmol/mgprot］of DM group elevated（P＜0.05），the activity of SOD［（68.96±3.82）U/mgprot］decreased（P＜0.05），the activities of TNOS（3.44±0.30）U/mgprot and iNOS（2.54±0.21）U/mgprot elevated significantly（all P＜0.05），the generation of NT［（42.66±3.14）］increased greatly（P＜0.05），the level of renal mass/body mass，24-hour urine protein and SCr rose greatly（P＜0.05）. After the intervention，renal mass/body mass，24-hour urine protein and SCr improved significantly（P＜0.05），MDA［（1.56±0.08）nmol/mgprot］lowered（P＜0.05），SOD［（76.44±4.90）U/mgprot］elevated（P＜0.05），the activity of iNOS［（2.54±0.21）U/mgprot］and the generation of NT（26.19±1.58）descended greatly（all P＜0.01）.The differences between cNOS（0.70±0.12）U/mgprot and cNOS（0.74±0.13）U/mgprot）of DM group had no statistical significance（P＞0.05）.Conclusion：NYPBR could significantly relieve renal cortex injuries of diabetes rat，which might be related to improving SOD activity，and decreasing iNOS activity and the generation of ONOO-.

diabetic nephropathy；oxidative stress；inducible NOS；peroxynitrite；nourishing Yin and promoting blood circulation recipe

R285.5

A

1004-6852（2016）06-0010-03

2015-12-02

梁金环（1970—），女，硕士学位，副教授。研究方向：糖尿病及其并发症的诊治。