兰州百合植物内生及根际土放线菌最适分离培养基的筛选研究

李增政，常永芳，林　滕，周　琴，李　涛

(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124)



兰州百合植物内生及根际土放线菌最适分离培养基的筛选研究

李增政，常永芳，林滕，周琴，李涛

(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124)

以兰州百合的鳞茎、根及根际土为实验材料，对其植物内生和根际土放线菌在不同的培养基上进行分离培养.根据不同培养基中所得放线菌菌落数量与种类，应用统计学方法，来选择出最适植物内生以及根际土放线菌生长的最适培养基.方法：对兰州百合鳞茎及根部表面消毒处理后，采用组织悬液法将原液涂布于添加抑菌剂的腐殖酸培养基、寡营养培养基、改良的高氏Ⅰ号等10种不同的培养基上.对根际土壤采用120 ℃预处理1 h，然后将处理后的根际土样作10-1、10-2、10-3梯度稀释并分别涂布于添加抑菌剂的SCA培养基、HVA培养基、葡萄糖—天冬氨酸琼脂培养基等7种不同的培养基上.置于23 ℃恒温培养箱中培养30 d，统计每个培养基上放线菌菌落数量及种类.结果：不同培养基分离兰州百合植物内生及根际土放线菌，其数量和种类有很大差异.其中，最适于百合鳞茎、根部内生及根际土放线菌生长的培养基分别为IMA-2琼脂培养基(共109株)、腐殖酸培养基(共662株)和改良高氏Ⅰ号培养基(共112株).

兰州百合；植物内生；根际土；放线菌；培养基

0　引言

兰州百合(Lilium davidii)为百合科百合属中能形成鳞茎的栽培种群，在我国主要采收其鳞茎作为食用或药用.我国是野生百合资源分布最广的国家，分布二十几个省份以及自治区,也是百合种植开发利用最早的国家.兰州百合品质出众，其所含蛋白质含量较高，是其他根茎蔬菜的2～5倍，并含有人体所需要的八种氨基酸.还含有多种维生素，其中维生素(核黄素)含量高(0.4 mg/g)，为一般蔬菜含量的10倍，与蛋类、豆类、动物肝脏中的含量相近.此外，甘肃省新医药研究所刘国权教授对兰州百合成分药理实验分析，结果认为：兰州百合丰富的锌元素可调节人体机理平衡，增强人体免疫力，对肝癌、肺癌等病都有一定的抑制作用.

现代医学发现，百合提取物对小白鼠肉癌S-180，子宫颈癌u-14有抑制作用；所含有的秋水仙碱对癌细胞的有丝分裂有抑制功能，能使其停止在中期.近年来兰州百合不断地应用于美容方面，具有排毒解毒的功效.

本实验通过采用组织悬液法处理兰州百合的鳞茎、根，120 ℃1 h处理兰州百合根际土，然后分别接种于改良高氏I号、腐殖酸培养基、几丁质培养基等10种植物内生放线菌培养基和SCA、甘油—精氨酸培养基、HVA等7种土壤放线菌培养基进行分离培养，并统计不同培养基中所得放线菌菌落数量与种类.应用统计学方法，根据统计结果，来选择出最适植物内生以及根际土放线菌生长的最适培养基，对未来快速分离兰州百合鳞茎和根内生放线菌以及根际土放线菌起着重要作用.

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样品

2014年3月8日采自于兰州市二十里铺海家岭乡百合种植地的3年生兰州百合及其根际土.

1.1.2主要试剂

0.1% Tween-20溶液，75% 乙醇溶液，2%的次氯酸钠溶液，10%的碳酸氢钠溶液，生理盐水，大量高温灭菌蒸馏水.

1.1.3主要药品

琼脂粉、可溶性淀粉、精氨酸、甘油、腐殖酸、甘露糖、酪素、核黄素、硫胺素、维生素B6、烟酸、肌醇、泛酸；磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钾、氯化钠、氯化钙；重铬酸钾、制霉菌素、放线菌酮、萘啶酮酸等.

1.1.4主要器材及仪器

9 cm培养皿、剪刀，镊子，酒精灯，酒精棉球，移液枪，枪头(蓝色、黄色)、研钵、超净工作台、恒温培养箱、pH计、蒸汽灭菌锅、摇床培养箱等.

1.2实验方法

1.2.1培养基的配制

表1植物内生放线菌培养基配方

1.2.2兰州百合鳞茎及根消毒处理

将采集的百合样品用自来水冲洗去掉表面的泥沙，用滤纸吸干表面的水分，对样品进行适当的修剪，使其鳞茎与根分开,然后在无菌超净台中进行处理.首先将百合组织鳞茎及根分别用浓度为0.1%的Tween-20 浸泡5分钟，无菌水冲洗干净.75%的酒精浸泡5分钟，无菌水润洗3次将表面的酒精冲洗干净.2%的次氯酸钠消毒5分钟，无菌水冲洗3次.10%的碳酸氢钠漂洗5分钟，无菌水润洗3次，但要留下最后一次清洗百合鳞茎及根的无菌水，装于小烧杯中，待用.

表2兰州百合根际土放线菌培养基配方

1.2.3兰州百合根际土采样及预处理

1.2.3.1土样采集与前期处理

采用五点采样法，选取五个点采样，使用铲子慢慢将兰州百合从土壤中铲出，在此过程当中不要伤及根部.然后轻轻地抖掉根部多余的土壤，之后用刷子刷取粘附于根系表面的土壤，收集于采样瓶中，之后置于无菌工作台无菌风下吹20 d.

1.2.3.2土样预处理

将无菌风吹过的土样进行120 ℃1 h预处理, 然后将处理后的根际土样作10-1、10-2、10-3梯度稀释.之后将处理后的土样加入无菌玻璃珠，至于摇床200 rpm，20 ℃处理30 min.

1.2.4放线菌的分离

本实验中抑菌剂统一为：重铬酸钾(50 μg/mL)，萘啶酮酸(20 μg/mL),放线菌酮(50 μg/mL)，制霉菌素(50 μg/mL).

将抑菌剂加入已灭完菌的培养基中(10 uL/mL，即每毫升培养基加入10 uL抑菌剂)，然后倒平板.

将表面消毒处理后的百合根、鳞茎用无菌滤纸吸干表面水分后，采用组织悬液法进行百合内生放线菌的分离.然后将处理后百合根、鳞茎的组织悬液分别涂布于十种培养基上.

组织悬液法就是向装有消毒后的百合鳞茎和根的研钵中分别加入10 mL生理盐水，进行研磨.静置10 min，吸取上清液200 μL于培养基上，涂布均匀.另外，将样品表面消毒留下的最后一次清洗百合鳞茎及根的无菌水分别吸取200 uL，分别涂布于改良高氏I号培养基上涂布均匀，作为空白对照.并将处理后的根际土样分别涂布于七种培养基上.

1.2.5放线菌的培养

将涂布后的平板，置于培养箱中培养，温度为23 ℃，时间为30 d，然后观察并计数.

2　结果

2.1兰州百合表面消毒

本实验将最后一次清洗植物表面的无菌水涂布到改良高氏I号培养基上，经过30 d的培养后发现平板上无菌生长，表明百合根和鳞茎表面无外源菌存在，培养基上生长的菌为百合根与鳞茎的内生菌.

2.1.1不同培养基分离百合根部内生放线菌

图1　不同培养基分离根内生放线菌的数量

图2　不同培养基分离根内放线菌种类

图1、图2为10种不同培养基上百合根内生放线菌的生长情况.从图中可见，经组织悬液法处理从腐殖酸维生素培养基(E3)分离放线菌的数量最多，共662株，5种不同菌株.E8、E2、E1分离放线菌数量分别为187株、150株、51株，菌株种类分别为7种、2种、15种；E7、E9、E10无放线菌生长.

2.1.2不同培养基分离百合鳞茎内生放线菌

图3　不同培养基分离鳞茎内生放线菌数量

图4　不同培养基分离鳞茎内生放线菌的种类

图3、图4为百合鳞茎内生放线菌的生长情况.由图可知采用组织悬液法从9种培养基上均分离到内生放线菌.E9分离内生放线菌的数量最多，共109株；E4分离内生放线菌的种类最多，共10种.而E10没有分离出任何百合内生放线菌.

2.1.3不同培养基分离百合根部及鳞茎内生放线菌

图5、图6为百合鳞茎、根内生放线菌数量及种类的比较.从数量上来看，大部分培养基根内生放线菌的数量及种类大于鳞茎内生放线菌.从E3培养基分离到的百合根内生放线菌数量最多，共662株；E1培养基分离百合根内生放线菌的种类最多，共15种.E9分离百合鳞茎内生放线菌数量最多，共109株；E4分离百合鳞茎内生放线菌种类最多，共10种.E10无放线菌生长，不适合百合内生放线菌的分离.

2.2分离到的放线菌数量

图5　鳞茎及根不同培养基生长放线菌的数量

图6　鳞茎及根不同培养基生长放线菌的种类

图7　不同培养基上菌的数目

实验从根际土中共获得354株菌落形态不同的放线菌，每种培养基上所生长的放线菌也各有差异.在图7中放线菌种类数由低到高为1<7<2<5<6<4<3，可得出3号培养基相对于其他培养基更适于根际土放线菌的生长.

3　结论

由统计分析发现，兰州百合内生放线菌无论是在数量上还是种类上都要优于百合根际土中放线菌.其中，最适兰州百合根际土放线菌生长的培养基为改良高氏Ⅰ号培养基.

在百合根中，从腐殖酸维生素培养基(E3)分离放线菌数量最多，共662株.寡营养培养基(E1)分离放线菌种类最多，共15种.百合鳞茎中的IMA-2琼脂粉培养基(E9)分离百合鳞茎内生放线菌数量最多，共109株.棉子糖-精氨酸培养基(E4)分离内生放线菌种类最多，共10种.燕麦片培养基(E10)没有分离出内生放线菌，可能该培养基不适合百合内生放线菌的分离.因此，最适于百合鳞茎、根部内生放线菌生长的培养基分别为IMA-2琼脂培养基、腐殖酸培养基.

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2015-12-10

李增政(1995—)，男，云南省临沧市人.

S682.29；Q948.1

A

1009-2102(2016)01-0038-07