哮喘患者外周血调节性T细胞和Th1/Th2的变化及其与哮喘病情的关系

孙德彬　熊雪芳　周家峰▲　兰　芬.浙江省丽水市中心医院呼吸科，浙江丽水　33000；.浙江大学医学院附属第二医院呼吸科，浙江杭州　30009

哮喘患者外周血调节性T细胞和Th1/Th2的变化及其与哮喘病情的关系

孙德彬1熊雪芳1周家峰1▲兰芬2
1.浙江省丽水市中心医院呼吸科，浙江丽水323000；2.浙江大学医学院附属第二医院呼吸科，浙江杭州310009

目的探讨调节性T细胞（Treg）和Th1/Th2水平变化与哮喘病情的关系，初步揭示哮喘的发病机制。方法选取2014年12月～2015年12月在呼吸科收治的150例患者和健康职工50例，检测哮喘患者（急性期和缓解期）和健康职工外周血中的调节性T细胞和Th1/Th2的变化，通过SPSS22.0软件对数据进行分析。结果哮喘患者Treg显著低于健康对照组［（2.3±0.3）%］（t=9.043，P=0.0032）。急性期组患者显著低于缓解期组和对照组（t=3.289，P=0.0321，t=9.884，P=0.0011），重度患者［（0.8±0.3）%］低于轻度患者［（1.5±0.4）%］，且具有显著性差异（t=8.945，P= 0.0055），缓解期组与健康组比较，无显著性差异（t=0.487，P=0.3291）。Th1/Th2水平在哮喘急性患者组显著低于对照组（11.8±0.8）和哮喘缓解期组（8.5±0.6）（t=12.884，P=0.0008；t=13.289，P=0.0007），表明在哮喘发作期时，Th亚群出现明显的失衡。哮喘患者急性期组重度患者Th1/Th2水平（4.8±0.9）显著低于轻度患者（9.5±0.8），具有显著性差异（t=8.432，P=0.0041）。Spearman相关性分析显示Treg水平越低，哮喘患者病情越严重，呈负相关关系（r= -0.854，P=0.025）；Th1/Th2水平越低，哮喘患者的病情也越严重，呈负相关关系（r=-0.635，P=0.035）。且Treg水平和Th1/Th2水平呈正相关关系（r=0.889，P=0.013）。结论哮喘患者的发病机制可能是随着患者病情的加重，过敏原对机体的刺激程度加剧，进而引起外周血中Treg所占比例降低，免疫调节功能受到损伤，Th2细胞开始大量增殖活化，而Th1细胞则受到抑制，导致Th1/Th2表现失衡，从而引起哮喘的发作。

哮喘；调节性T细胞；发病机制；免疫调节；过敏原

［Abstract］Objective To discuss the re1ations between changes of Treg and Th1/Th2 and asthma.Methods 150 patients treated from December 2014 to December 2015 in our department and 50 hea1thy vo1unteers were se1ected to detect the changes of Treg and Th1/Th2 in periphera1 b1ood of asthma patients（at acute stage and remission stage）and hea1thy subjects.The data was ana1yzed by SPSS22.0.Results The 1eve1 of Treg was significant1y 1ower in the asthma patients than in the hea1thy contro1 group［（2.3±0.3）%］（t=9.043，P=0.0032），a1so significant1y 1ower in the acute stage group than in the remission stage group and the hea1thy contro1 group（t=3.289，P=0.0321，t=9.884，P=0.0011），and was significant1y 1ower in severe patients［（0.8±0.3）%］than in mi1d patients［（1.5±0.4）%］.There was no significant difference in Treg between the remission stage group and the hea1thy contro1 group（t=0.487，P=0.3291）.The 1eve1 of Th1/Th2 was significant1y 1ower in the acute asthma patients（4.8±0.9）than in the hea1thy contro1 group（11.8±0.8）and the remission stage group（8.5±0.6）（t=12.884，P=0.0008；t=13.289，P=0.0007），indicating significant unba1ance of Th subgroup in the onset period of asthma.In the acute stage group，the Th1/Th2 1eve1 of severe patients（4.8±0.9）was significant1y 1ower than that in mi1d patients（9.5±0.8），（t=8.432，P=0.0041）.Spearman corre1ation ana1ysis showed a negative corre1ation that a 1ower 1eve1 of Treg meant a severer condition of asthma（r=-0.854，P=0.025），a1so a negative corre1ation that a 1ower 1eve1 of Th1/Th2 meant a severer condition of asthma（r=-0.635，P=0.035），and a positive corre1ation between 1eve1 of Treg and 1eve1 of Th1/Th2.Conclusion Pathogenesis of asthma is possib1e to be that a1ong with the severity of disease，the stimu1ation of a11ergen is aggravating，causing proportion decrease of Treg in periphera1 b1ood and damage to the immune modu1ating function，1eading to pro1iferation and activation of Th2 ce11s and inhibition of Th1 ce11s，resu1ting in unba1ance of Th1/Th2 and causing onset of asthma.

［Key words］Asthma；Regu1atory T ce11；Pathogenesis；Immunoregu1ation；A11ergen

哮喘作为一种常见的慢性疾病，其主要病理学特征主要是呼吸道炎性反应和气道重塑［1，2］。在哮喘发病中，Th1/Th2功能失调扮演重要角色［2］。因子IFN-γ由细胞Th1分泌，IL-4由细胞Th2分泌［3］。近期文献多报道引起哮喘的重要环节是免疫耐受受到破坏［4］。调节性T细胞（Regu1atory T ce11，简称Treg）作为可以控制体内自身免疫反应的一类细胞，具有以下两个特点：一是能表达胞外表面分子CD4和CD25，二是可以表达细胞核内蛋白Foxp3，Treg的特异性标志就是这个Foxp3蛋白［5］。已有文献报道Foxp3突变的小鼠常会出现敏性气道炎症，IgE和嗜酸性粒细胞出现明显增高，且Th1/Th2表现出失衡［6］。在2003年，美国医学家 Fontenot等研究发现 CD4+CD25+Treg数目在Foxp3突变鼠和Foxp3缺失的鼠体内显著减少［7］。在T细胞的亚群和细胞因子的相互作用方面，科研工作者展开了大量的研究，本文希望通过检测哮喘患者和正常患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Treg）以及Th1/Th2比值变化，从而探讨哮喘病情与其的关系，以期能够在诊断和治疗哮喘患者方面提供一定的数据支持，为进一步发掘哮喘的发病机制奠定理论基础。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2014年12月～2015年12月在本院呼吸科收治的150例患者，其中男90例，女60例，年龄35～60岁，平均年龄（41.4±3.4）岁。纳入标准：（1）按照中国医学会呼吸病学分会哮喘学组指定的《支气管哮喘防治指南》［8］，确诊为哮喘的患者；（2）患者入组前1周未使用糖皮质激素或其他免疫抑制剂；（3）无急性感染，无其他慢性病史；（4）患者及其家属知情并且积极配合参与本项目。排除标准：（1）确诊为哮喘但伴随其他严重慢性疾病；（2）患者无法配合完成整个项目。入选的150例患者，按照临床的表现又被分为急性期组（100例）和缓解期组（50例）。其中急性期组又分为重度组（50例）和轻度组（50例）。本研究选取本院各项体检正常的职工作为对照组，共50例，其中男30例，女20例，年龄36～61岁，平均（42.0±3.3）岁，对照组职工均无过敏性疾病，并且近期无呼吸道感染。分别对各组患者外周血中的调节性T细胞（Treg）和Th1、Th2的比例进行检测观察。

1.2实验试剂和设备

1.2.1实验试剂 所用试剂均从美国的eBioscience公司和BD Phar Mingen公司采购获得。其中采购自美国的eBioscience公司试剂有：异硫氰酸光素（FITC）标记的鼠抗人CD4单克隆抗体、藻红蛋白（PE）标记的鼠抗人单克隆抗体以及其相匹配的同型对照。藻蓝蛋白（APC）标记的鼠抗人Foxp3单克隆抗体和Fixation/ Perm以及刺激剂（Leukocyte Activation Cocktai1）。采购自BD PharMingen公司的试剂有：PE-CY5（PC5）标记的鼠抗人CD3单克隆抗体、PC7标记的鼠抗人CD8单克隆抗体、FITC标记的鼠抗人IFN-γ单克隆抗体和PE标记的鼠抗人IL-4单克隆抗体，Fix&Perm。自配0.83%的氯化铵作为红细胞裂解液，0.5%小牛血清PBS作为洗涤液。

1.2.2设备流式细胞仪，型号为FACSCanto，厂家为美国的BD公司。

1.3方法

1.3.1全血制备 清晨空腹抽取哮喘患者和健康对照组的1 mL静脉血于使用肝素抗凝的管中，然后备用。

1.3.2Treg检测方法调节性T细胞检测使用美国BD公司的流式细胞仪，其型号为FACSCanto，数据分析使用Ce11quest软件，对CD4+细胞中Foxp3+细胞百分率进行计算。其检测过程如下：首先取100 μL 1.3.1制备的全血，然后加入CD4-FITC与CD25-PE刺激剂10 μL，在4℃避光条件下孵育30 min；之后直接加入1 mL氯化铵红细胞裂解，保持10 min，结束后使用PBS进行洗涤，共3次，离心条件为：转速12 000 rpm/min，时间为5 min；1 mL Fixation/Perm缓冲液穿膜45 min，取10 μL APC标记的鼠抗人Foxp3单克隆抗体直接加进洗涤缓冲液，在4℃下，避光孵育30 min。将破膜液洗涤2次，然后直接加入300 μL流式细胞染色缓冲液，重悬，进而Treg检测［9］。

1.3.3Th1/Th2检测方法 取100 μL 1.3.1制备的全血，按照1：1等体积加入RPMI1640进行稀释，然后加入刺激剂10 μL，培养箱培养4～6 h，培养条件为37℃，5%CO2。结束后混匀，然后加入10 μL CD3-PC5 和10 μL CD8-PC7，在室温条件下，避光孵育15 min；结束后加入100 μL Fix&Perm中的固定液：Reagent1，将其固定，然后在室温条件下避光孵育15 min；孵育结束后加入3 mL PBS清洗，在转速为12 000 rpm条件下离心5 min，倒掉上清。然后取100 μL Fix&Perm中的破膜和溶血液：Reagent2，加入，同时再加入10 μL IFN-γ-FITC和IL-4-PE于各管中，在室温条件下避光孵育15 min［10］。结束后取3 mL PBS加进各管中，在转速为12 000 rpm条件下离心5 min，倒掉上清。最后再取0.5 mL PBS加入，将细胞重悬，进行检测。

1.4统计学方法

采用SPSS22.0软件对数据进行处理分析，计量资料以均数±标准差（±s）进行统计学描述［11］，测定数值的方差齐性检验采用Levene's Test，若方差齐行t检验，若方差不齐采用 Satterthwaite近似t检验［12］，使用Spearman相关分析法对数据相关性进行分析，P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示差异有高度统计学意义。

2　结果

2.1哮喘患者与健康对照组CD4+CD25+Foxp3+Treg水平比较

哮喘患者CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T比例达（1.6±0.4）%，显著低于对照组［（2.3±0.3）%］（t=9.043，P=0.0032）。哮喘患者急性期组患者CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T比例为（1.1±0.4）%，显著低于缓解期组和对照组（t=3.289，P=0.0321；t=9.884，P=0.0011）。缓解期组与对照组对比，无显著性差异（t=0.487，P= 0.3291）。急性期组重度患者［（0.8±0.3）%］低于轻度患者［（1.5±0.4）%］，且具有显著性差异（t=8.945，P=0.0055）。见表1。

表1　两组CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分率比较（±s，%）

表1　两组CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分率比较（±s，%）

注：a急性期组与对照组比较，b缓解期组与急性期组比较，c缓解期组与对照组比较

组别　CD4+CD25+Foxp3+Treg对照组哮喘患者组急性期组重度轻度缓解期组t值t值a t值b t值c 2.3±0.3 1.6±0.4 1.1±0.4 0.8±0.3 1.5±0.4 1.9±0.3 9.043（P=0.0032）9.884（P=0.0011）3.289（P=0.0321）0.487（P=0.3291）

2.2哮喘患者与健康对照组Th1/Th2比较

Th1/Th2水平在哮喘急性期患者组显著低于对照组 （11.8±0.8）和哮喘缓解期组 （8.5±0.6）（t= 12.884，P=0.0008；t=13.289，P=0.0007），表明在哮喘发作期时，Th亚群出现明显的失衡。哮喘患者急性组重度患者Th1/Th2水平（4.8±0.9）显著低于轻度患者（9.5±0.8），具有显著性差异（t=8.432，P=0.0041）。见表2。

表2　两组Th1/Th2水平比较（±s）

表2　两组Th1/Th2水平比较（±s）

注：a急性期组与对照组比较，b缓解期组与急性期组比较，c缓解期组与对照组比较

组别Th1/Th2对照组哮喘患者组　急性期组重度轻度缓解期组t值a t值b t值c 11.8±0.8 6.5±0.4 4.8±0.9 9.5±0.8 8.5±0.6 12.884（P=0.0008）13.289（P=0.0007）10.345（P=0.0015）

2.3哮喘患者Treg水平和Th1/Th2变化与哮喘病情关系

通过Spearman相关性分析，结果显示出Treg水平越低，哮喘患者病情越严重，呈负相关关系（r=-0.854，P=0.025）；Th1/Th2水平越低，哮喘患者的病情也越严重，呈负相关关系（r=-0.635，P=0.035）。且Treg水平和Th1/Th2水平呈正相关关系（r=0.889，P=0.013）。

3　讨论

支气管哮喘作为一种慢性气管炎疾病，有多种炎症细胞参与和介导［13，14］。近年来其在世界各地发病率和致死率呈现递增趋势［15］，严重威胁着人类的健康［16］，由于其反复发作，并且难以根治，给患者带来严重经济负担和巨大的精神压力［17］。Treg是近些年来研究发现的具有免疫抑制效应的T细胞［18］，在维持机体和抑制自身免疫疾病方面起着重要作用，研究显示大部分Treg细胞为CD4+T细胞，可以使机体通过调节免疫外周耐受来控制免疫性疾病［19］。随着研究的进一步深入，辅助性T细胞（Th1/Th2）在哮喘患者当中的研究越来越受重视［20］。Th1和Th2可以通过分泌细胞因子，彼此之间进行相互交叉作用［21］。

本研究通过检测哮喘患者外周血调节性T细胞和Th1/Th2的变化，探讨了其与哮喘患者病情的关系，研究发现哮喘患者CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T比例达（1.6±0.4）%，显著低于健康对照组［（2.3± 0.3）%］（t=9.043，P=0.0032）。哮喘患者急性期组患者CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T比例为（1.1±0.4）%，显著低于缓解期组和对照组（t=3.289，P=0.0321；t=9.884，P=0.0011）。缓解期组与健康组对比，无显著性差异（t=0.487，P=0.3291）。急性期组重度患者［（0.8±0.3）%］低于轻度患者［（1.5±0.4）%］，且具有显著性差异（t= 8.945，P=0.0055）。Th1/Th2水平在哮喘急性期患者组显著低于对照组（11.8±0.8）和哮喘缓解期组（8.5±0.6）（t=12.884，P=0.0008；t=13.289，P=0.0007），表明在哮喘发作期时，Th亚群出现明显的失衡。哮喘患者急性组重度患者Th1/Th2水平（4.8±0.9）显著低于轻度患者（9.5±0.8），具有显著性差异（t=8.432，P=0.0041）。Spearman相关性分析显示出Treg水平越低，哮喘患者病情越严重，呈负相关关系（r=-0.854，P=0.025）；Th1/Th2水平越低，哮喘患者的病情也越严重，呈负相关关系（r=-0.635，P=0.035）。且Treg水平和Th1/Th2水平呈正相关关系（r=0.889，P=0.013）。

综上，目前关于哮喘患者Treg水平和Th1/Th2与病情的关系的报道比较少，本研究发现哮喘在发作期时，重度患者外周血的Treg水平和Th1/Th2比值明显降低，且在病情发展过程中保持了较强的一致性。可以推测出，哮喘患者的发病机制可能是随着病情的加重，机体受到过敏原的刺激加剧，导致患者外周血中Treg所占比例降低，免疫调节功能受到损伤，Th2细胞开始大量增殖活化，而Th1细胞则受到抑制，从而导致Th1/Th2表现失衡，大量制炎因子开始产生，从而引起哮喘的发作。

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Changes of peripheral blood regulatory T cells and Th1/Th2 and their relations with asthma

SUN Debin1XIONG Xuefang1ZHOU Jiafeng1LAN Fen2
1.Department of Respiration，Lishui Centra1 Hospita1 in Zhejiang Province，Lishui323000，China；2.Department of Respiration，the Second Affi1iated Hospita1 of Zhejiang University，Hangzhou310009，China

R562.25

A

1673-9701（2016）16-0006-04

浙江省自然科学基金（LY15H010002）

2016-03-04）