不同生育期苹果园土壤氨氧化微生物丰度研究

李景云， 秦嗣军， 葛 鹏， 吕德国， 刘灵芝*

(1 沈阳农业大学土地与环境学院， 沈阳 110866;2 沈阳农业大学园艺学院/辽宁省果树品质发育与调控重点实验室， 沈阳 110866)



不同生育期苹果园土壤氨氧化微生物丰度研究

李景云1， 秦嗣军2， 葛 鹏1， 吕德国2， 刘灵芝1*

(1 沈阳农业大学土地与环境学院， 沈阳 110866;2 沈阳农业大学园艺学院/辽宁省果树品质发育与调控重点实验室， 沈阳 110866)

氨氧化微生物； 丰度； 果园酸性土壤； 环境因子； 荧光定量PCR

果园土壤长期过量施入氮肥导致土壤硝态氮过量累积问题突出，土壤氮素淋失程度显著高于一般农田土壤[1]。辽宁省丹东东港地区自上个世纪90年代初最先开始种植寒富苹果，近年来果园土壤逐渐呈酸化趋势，苹果锰中毒引起的粗皮病[2]、 果实钙失调等生理障碍发生较重，制约着寒富苹果的优质安全生产。

硝化作用是土壤氮循环的重要环节，由氨氧化微生物 (氨氧化细菌, ammonia-oxidizing bacteria， AOB； 氨氧化古菌, ammonia-oxidizing archaea， AOA)参与完成的氨氧化过程是硝化作用的限速步骤，在土壤氮库调节方面起着不可替代的作用[3]。氨氧化微生物参与的土壤硝化作用不仅影响果园土壤的进一步酸化，对果园土壤中无机氮素的有效性也具有重要影响。编码参与氨氧化过程主要酶类的氨单加氧酶(AMO)基因amoA具有较强的保守性，常作为氨氧化微生物的分子标记在许多研究领域被广泛应用[4]。研究表明，不同土壤生态系统中AOA与AOB的种群多样性和amoA基因丰度存在明显差异[5-6]。AOA多主导酸性土壤中的硝化作用，而AOB则主导中性和碱性土壤中的硝化作用[7]。由于AOA和AOBamoA基因丰度及比值与环境因子密切相关[8-10]，Wessén等[11]提出氨氧化古菌和细菌的amoA基因丰度可作为生物指标，在一定程度上反映土壤理化因子(氮肥、 pH等)的变化[12-14]。与传统清耕制果园土壤环境日趋恶化相比，实行生草制、 提倡施加有机肥等对于重建果园土壤健康具有重要意义。本试验针对该区域多年清耕和生草且不同施肥管理的两种土壤管理方式苹果园，在不同生育时期(萌芽期、 新梢停长期和落叶期)，采用实时荧光定量PCR技术，研究果园土壤中氨氧化古菌和氨氧化细菌丰度，结合环境因子与硝化强度分析，以期为预警土壤质量变化，科学调控苹果园土壤环境，促进植株生长发育等提供理论依据。

1　材料与方法

1.1土壤样品采集及处理

采样地点位于辽宁省丹东地区东港市长山镇七股顶村两个相邻果园，编号分别为D1和D2。果园为浅缓丘陵地，海拔7至20 m，土壤为棕壤。其中，D1果园自2001年栽植寒富苹果，果园土壤采用清耕管理； D2果园自1995年栽植寒富苹果，果园土壤采用自然生草、 人工刈割管理。两园施用化肥的时间、 种类基本相同，均为每年4月上旬以尿素和磷酸二铵为主配施少量复合肥、 6月下旬施复合肥、 9月上旬施复合肥和硫酸钾，个别年限还少量施用钙镁硼等肥料。全年氮磷钾施肥量折合: D1果园N、 P2O5、 K2O分别为485、 85、 443 kg/hm2，D2果园N、 P2O5、 K2O分别为418、 143、 300 kg/hm2。另外，D1和D2果园于9月上旬各撒施少量鸡粪与秸秆堆沤的农家肥15 t/hm2和37.5 t/hm2。

试验分别于2012年4月28日(萌芽期)、 7月24日(新梢停长期)、 10月23日(落叶期)采样。取样点位于树冠下，距树干1.5 m处。垂直向下取0—20 cm的土壤样品，去除表层尚未腐烂的杂草等覆盖物，5点采样混合处理作为1次重复，去除根系和石砾等土壤入侵物，采用“四分法”取1 kg土样于4℃冰箱保存备用，每个果园取3个重复土样。土壤理化性质测定参照鲍士旦等[15]方法。

1.2土壤硝化强度测定

土壤硝化强度的测定参照赵爽等[16]的方法: 称取5 g鲜土样3份，分别置于100 mL三角瓶中，加2.5 mL NaClO3(75 mmol/L)，其中两份在25℃下培养24 h，另一份置于-20℃冰箱中24 h作对照。培养结束后每份加5 mL去离子水、 10 mL 2 mmol/L KCl溶液，完全摇匀后立即过滤，吸取5 mL滤液放入试管中，加3 mL NH4Cl缓冲溶液(0.19 mmol/L, pH 8.5)、 2 mL磺胺试剂，摇匀后室温下放置15 min，520 nm波长下比色。按以下公式计算:

1.3土壤微生物总DNA提取

土壤微生物DNA的提取采用CWBIO Soil Gen DNA Kit说明书方法进行。获得DNA样品后用微量核酸蛋白质分析仪(Nanodrop2000 UV-Vis Spectrophotometer, Thermo Scientific)测其浓度，并采用琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的质量，-20℃保存。

1.4荧光定量PCR

表1　AOA和AOB定量PCR 扩增引物及反应条件

2　结果与分析

2.1不同生育时期寒富苹果园土壤基本理化性质和硝化强度

不同采样时期的果园土壤硝化强度表明，果园土壤硝化强度随季节变化表现出先降后增的趋势(图1)，除7月份D2果园土壤硝化强度显著高于D1果园土壤外，4月与10月D2果园土壤硝化强度均显著低于D1果园土壤。

图1　不同生育时期苹果园土壤硝化强度的变化Fig.1　Potential nitrification of soils at different growth stages of apple

表2　不同生育时期苹果园土壤理化性质

注(Note): D1—果园1 Orchard 1； D2—果园2 Orchard 2. 表中数据为平均值±标准误差，数值后不同字母表示不同采样期处理间差异显著 Data are mean±standard error. Values followed by different letters indicate significant differences among treatments of different sampling dates (P<0.05).

2.2不同生育期土壤氨氧化微生物种群丰度的变化情况

由图2所示，同一采样时期，D2果园土壤的AOA和AOBamoA基因拷贝数均显著高于D1土壤； 随生育期延长，D1果园土壤AOAamoA基因表达量呈上升趋势，D2果园土壤除4月显著高于后两个时期，后两个时期无显著差异； D1果园土壤 AOBamoA基因随生育期延长先增后降，D2果园土壤却表现出一定的上升趋势。

图2　不同生育时期苹果园土壤中氨氧化微生物amoA基因的丰度与比值Fig.2　Abundances and ratios of amoA gene of AOA and AOB in soils at different growth stages of apple[注(Note): D1—果园1 Orchard 1； D2—果园2 Orchard 2. 方柱上不同字母表示处理间在0.05水平差异显著 Values followed by different letters are significantly different among treatments at 0.05 level. ]

2.3不同生育时期氨氧化微生物丰度与土壤硝化强度(PN)和土壤理化性质的相关关系

表3　氨氧化微生物丰度和土壤硝化强度、 理化性质的相关性分析

注(Note): PN—土壤硝化强度Potential nitrification; *—P<0.05; **—P< 0.01.

3　讨论

果树不同生育期，因温度、 水分、 施肥量等因素的改变，可导致植株根系分泌物的变化，进而影响土壤理化性质与土壤微生物种群及其活性的相互关系[10]。本研究采用实时荧光定量PCR 技术研究了不同生育时期寒富苹果园土壤氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)的丰度，并分析了氨氧化微生物丰度与土壤硝化强度及环境因子之间的相关性。

氨氧化微生物的硝化潜能、 土壤氮素养分有效性以及果树氮素养分吸收利用三者之间相互作用，密切相关。微生物合成的胞外酶是调控氮素转化的重要因素，施肥处理、 不同生育时期根系生理活性及土壤环境因子的差异都将形成不同功能的微生物群落，从而改变土壤脲酶、 磷酸酶和蛋白酶等的合成与活性，干扰氮转化的酶调控过程[32]。一些报道认为，苹果是喜硝植物，尽管一些施肥处理整体上可以增加土壤氨氧化细菌的数量，与AOB相比，不论有机肥、 无机肥单独施用还是配施，AOA多为土壤硝化作用的优势类群[33]。因此，在果树根系-硝化微生物-果园土壤氮循环系统中，长期或过量施用氮素养分直接或间接地改变根际环境，影响了氨氧化微生物的种群结构组成与活性，进而影响了植株根系对氮素吸收利用。由于AOA和AOB分别主导不同pH条件下土壤氮代谢的转化过程，而果园pH值与施肥及土壤管理等有密切的关系。因此，通过检测AOA与AOB种群结构、 基因丰度与硝化活性的变化，作为潜在的土壤环境预测指标，分析氮肥施入与土壤酸化的关系，可为科学调控果园投入氮肥种类、 数量，减缓土壤酸化，维持果园肥力提供参考依据。

4　结论

不同生育时期‘寒富’苹果园土壤理化性状、 氨氧化微生物丰度及土壤硝化强度均表现出不同程度的差异。苹果园土壤受长期施肥影响逐渐呈酸化趋势，AOA是苹果园土壤硝化作用的优势类群，与土壤pH值变化呈显著正相关。土壤硝化强度受多种土壤环境因子的调控，苹果园无机氮肥混合有机肥的施入，同时自然生草、 人工刈割等管理制度，可在一定程度上改变土壤AOA与AOB的丰度与比例，以及土壤氮素的含量与种类，减缓土壤酸化。

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Abundance of ammonia oxidizers in apple orchard soil at different growth stages

LI Jing-yun1, QIN Si-jun2, GE Peng1, LÜ De-guo2, LIU Ling-zhi1*

(1CollegeofLandandEnvironment,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China；2CollegeofHorticulture/KeyLabofFruitQualityDevelopmentandRegulationofLiaoningProvince,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China)

ammonia oxidizer; abundance; orchard acidic soil; environmental factor; real-time PCR

2015-01-26接受日期: 2015-04-01网络出版日期: 2015-12-11

国家自然科学基金项目(31101504, 31171917)； 中国博士后科学基金项目(2011M500575)； 辽宁省高等学校果树栽培与生理生态创新团队(LT2014014)； 辽宁省苹果科技创新团队(2014204004)； 辽宁省高等学校优秀人才支持计划(LJQ2014070)； 沈阳市大型仪器共享服务专项(F14-194-4-00)资助。

李景云(1988—)， 女， 河北邯郸人， 硕士研究生， 主要从事土壤微生物研究。 E-mail: lijingyun08@163.com

E-mail: liulingzhi2006@163.com

S154.54

A

1008-505X(2016)04-1149-08