MicroRNA调节豆科作物营养胁迫响应的研究进展

徐 锋, 王金祥

(亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，华南农业大学农学院，广州 510642)



MicroRNA调节豆科作物营养胁迫响应的研究进展

徐 锋, 王金祥*

(亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，华南农业大学农学院，广州 510642)

miRNA; 营养胁迫; 豆科作物

豆科作物，如大豆(Glycine max)、 菜豆(Phaseolus vulgaris)、 鹰嘴豆(Cicerarietinum)、 花生(Arachis hypogea)及紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界范围内广泛种植的重要粮油与饲料作物，为人类提供植物蛋白。随着世界人口的增加，人类对植物蛋白的需求也越来越大。据资料显示，豆科作物的产量约占世界初级农产品的三分之一[1]。值得关注的是，豆科作物与根瘤菌形成共生体，固定大气中的氮，在生态系统氮循环过程中起重要作用[2]。此外，豆科作物与菌根真菌共生，改善土壤磷营养的状态[3]。因此，豆科作物也是环境友好型作物。

1　miRNA的形成与作用机理

在植物中，真正能降解mRNA的是成熟的miRNA，其形成需要经过复杂的生物合成过程[9]。miRNA基因在II型RNA聚合酶 (RNAPolymeraseII，PolII)催化下进行转录[10]，其产物是包含成熟miRNA片段的发夹结构的前体，称为初级miRNA(primarymiRNA，pri-miRNA)，核糖核酸酶DICER-LIKE1(DCL1)、 锌指蛋白SERRATE(SE)以及双链结合蛋白HYPONASTICLEAVES1(HYL1)对pri-miRNA进行剪切加工，生成miRNA前体(precursormiRNA，pre-miRNA)[11];DCL1和HYL1对其再进行加工生成miRNA双链片段(miRNA/miRNA*duplex)[12-13]。接着在甲基化酶HUAENHANCER1(HEN1)的作用下，将双链miRNA两端的羟基甲基化而避免被降解[14]。最后在运转蛋白HASTY(HST)帮助下将miRNA/miRNA*从细胞核运送至细胞质中[15]。成熟miRNA的其中一条链装载到Argonaute1(AGO1)蛋白上形成RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomples，RISC)[16]，RISC结合至靶基因的mRNA上，在复合体中被miRNA识别的mRNA将被降解或因miRNA结合在3′非翻译区(UTR)而抑制其翻译水平[17](图1)。近年的研究发现，植物中尚有其他蛋白参与miRNA合成。如DAWDLE(DDL)蛋白与DCL1交互作用，稳定pri-miRNA转录水平[18]; 拟南芥一个富含脯氨酸蛋白逆境响应基因SICKLE(SIC)也参与miRNA的生物合成[19];STABILIZED1(STA1)蛋白能直接作用于pri-miRNA的剪切，从而间接调控DCL1的转录水平[20];RNA结合蛋白MOS2通过增加miRNA剪切复合体对pri-miRNA的收集，促进pri-miRNA的加工[21]。

图1　植物miRNAs生成示意图Fig.1　Biogenesis of plant miRNAs

[注(Note):Nuc.—细胞核Nucleus;Cyt.—细胞质Cytoplasm; MIRNA—MIRNA基因MIRNAgenes;Pri-miRNA—初生miRNAPrimarymiRNA;Pre-miRNA—miRNA前体PrecursormiRNA;MiRNA/miRNA*—miRNA双链miRNA/miRNA*duplex;PolⅡ—RNA聚合酶ⅡRNAPolymeraseⅡ;DCL1—核糖核酸酶DICER-LIKE1;HYL1—双链结合蛋白HYPONASTICLEAVES1;SE—锌指蛋白SERRATE;HEN1—甲基化酶HUAENHANCER1;HST—运转蛋白HASTY;AGO1—ARGONAUTE1蛋白ARGONAUTE1.

从图1可以看出，DCL蛋白和AGO蛋白在miRNA形成过程中起重要作用。以往研究表明，大豆基因组含有6个DCL基因(GmDCL1a、 GmDCL1b、 GmDCL2a、 GmDCL2b、 GmDCL3a、 GmDCL4a)[22], 但在苜蓿基因组，仅存在各一个拷贝的DCL1，DCL2和DCL3基因[23-24]。生物信息学分析表明，大豆、 苜蓿、 百脉根基因组分别含有21、 12和9个AGO基因[25]。这些研究证明，豆科植物大豆、 苜蓿、 百脉根等基因组均存在拟南芥基因组与miRNA生物合成和加工有关的同源基因，因此豆科植物miRNA形成机理可能与拟南芥等模式植物相似，但还有待开展深入研究。

2　miRNA调节植物生长发育及对养分逆境适应性反应

miRNA通过对靶基因的调节影响植物生长发育。Nikovics等[26]研究发现，miR164a能对CUC2g的表达进行调节，抑制拟南芥锯齿状叶片的产生。Vidal等[27]报道了miR393参与了拟南芥根系构型对不同氮水平的响应，miR393的靶基因编码一个生长素受体AFB3，而AFB3特异调控氮素对根系构型的塑造。最新的研究还指出，miR393还参与了拟南芥叶片的发育[28]，miR393抑制TIR1/AFB2生长素受体基因的表达，从而调控植物对生长素的感应以及与叶片发育相关部位的生长素感应。

miRNA在植物的营养胁迫响应中同样扮演重要角色。miR395参与调节拟南芥体内硫酸盐的累积与分配[29]。miR395的靶基因包含了两个基因家族，分别是由APS基因编码的ATP硫酸化酶以及硫酸盐转运子SULTR2; 1。在过量表达miR395的拟南芥体内，这两个基因家族的表达受到强烈的抑制，导致地上部硫高度累积。

miR399是一个特异受低磷诱导表达的miRNA，其靶基因是E2结合酶[30-31]。前人的研究发现，拟南芥pho2突变体在叶部积累大量磷，但对根部没有影响[32-33]。对PHO2基因进行图位克隆后发现其编码E2结合酶，并受miR399负调控，高磷条件下PHO2可能抑制下游一些磷响应的基因如Pht1; 8等表达[34]。最近的研究证实:PHO2在内质网中与磷转运蛋白PHT1相互作用，调控磷转运蛋白的泛素化而调节拟南芥磷吸收[35]。拟南芥miR827也是一个受低磷特异诱导上调表达的miRNA，其靶基因为NLA(Nitrogen Limitation Adaptation)，NLA蛋白C端含有一个具E3连接酶活性的RING结合域[36-39]。最近的实验证明，NLA蛋白与磷转运蛋白PHT1在细胞膜上互作，通过招募PHO2来控制拟南芥磷转运子的泛素化而调节磷转运子的降解，从而调控植株磷吸收及磷平衡[40-41]。Abdel-Ghany等[42]的研究指出，拟南芥中miR397、miR408和miR857通过下调铜蛋白的表达从而适应低铜胁迫，同时也提出了miRNA通过抑制植物中非重要蛋白的表达来节省体内的铜，将之供应到更需要的组织，使植物适应低铜逆境。

目前，针对miRNA参与植物的生长发育及适应逆境的机理在其它模式植物上已经有较深入的研究，但对豆科植物miRNA调控生长发育、 生物和非生物胁迫响应机制的研究较少。近年来，豆科植物大豆(Glycine max)，蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)，以及百脉根(Lotus japonicus)等已成为良好的模式植物，利用高通量测序(High-throughputsequencing)技术对豆科植物sRNA进行鉴定的研究逐渐增多，关于豆科植物miRNA的研究也越来越多。目前，在miRBase(www.mirbase.org)数据库可检索到554个成熟的大豆miRNA序列，756个蒺藜苜蓿miRNA成熟序列，67个百脉根成熟miRNA序列。

3　miRNA在豆科植物营养胁迫响应中的功能

3.1miRNA在豆科植物磷营养胁迫响应中的功能

磷是植物生长发育所必需的大量元素之一，在植物的光合反应、 呼吸作用和其他生理生化过程中起着重要作用，是植物完成生命周期不可缺少的元素。但是施入土壤中的磷肥易被表层土壤束缚或以有机磷形态被固定，成为植物难以利用的磷，造成土壤有效磷缺乏[43-44]。因此研究豆科作物适应低磷养分胁迫的机理，挖掘豆科作物自身对磷的高效吸收利用潜力，提高豆科作物在低磷条件的产量已成为植物营养研究领域的热点。

越来越多的证据表明，miRNA在豆科作物养分胁迫响应中起重要作用。在植物中，miR399是一类保守的受磷特异诱导表达的miRNA，其作用机理在拟南芥和水稻中已有较深入的研究[31,45]。菜豆miR399 (pvu-miR399)同样介导磷信号转导。研究发现菜豆中一个与拟南芥基因AtPHR1同源的MYB类转录调控因子编码基因PvPHR1，受低磷诱导; 而pvu-miR399受PvPHR1的正调控，并抑制泛素结合酶E2的表达。这说明菜豆存在与拟南芥一致的miR399调控低磷响应信号途径[46]。此外，基于高密度miRNA基因表达芯片技术(macroarrays)，Valdés-López等[47]发现在菜豆中有10个miRNAs(miR157、miR160、miR165、miR166、miR169、miR393、pvu-miR2118、gma-miR1524、gma-1526、gma-miR1532)分别在叶部、 根部与根瘤不同程度地受低磷调控。在磷缺乏的情况下，与未受侵染的相比，菌根菌侵染的蒺藜苜蓿根部miR399表达显著上调，而其靶基因MtPHO2的表达显著下调[8]。Ramírez等[48]比较了低磷耐受型菜豆BAT477与低磷敏感型菜豆DOR364在磷亏缺情况下的表现，BAT477比DOR364积累更多的磷以及有更高生物量的根系。通过研究发现，在两个不同基因型菜豆中，pvu-miR399靶定PvPHO2的位点均在5′UTR，并且有5个靶定位点。但除了4个靶定位点的序列一致外，有1个靶定位点在两个基因型中出现了差异; 相较于DOR364的完全匹配，BAT477在此位点上有3个碱基不匹配，导致miR399对BAT47 PHO2 基因转录本切割效率下降。暗示pvu-miR399靶定效率的差异可能决定两个基因型适应低磷胁迫的差异。拟南芥IPS1基因是一类非编码RNA基因，受低磷诱导表达，IPS1基因的核心区域与miR399的成熟序列高度互补配对[49]。拟南芥IPS1基因的mRNA能作为一种靶基因模拟物(targetmimics)而诱捕miR399，从而限制miR399对PHO2的剪切，维持拟南芥在低磷条件下体内磷营养的动态平衡[50]。在蒺藜苜蓿、 大豆等豆科植物中也发现了与拟南芥IPS1高度同源的基因家族[51-52]，暗示豆科植物中也存在与拟南芥相类似的机制，即通过植物内源的靶基因模拟物来下调miRNA的介导作用，使植物保持体内磷动态稳定。

利用深度测序(deepsequencing)技术，Zhu等[53]鉴定了白羽扇豆中不同部位的磷响应miRNA，并发现了共有属于35个miRNA基因家族的167个miRNA受低磷的明显影响。35个基因家族中，17个在根部表达上调，7个表达下调; 茎部有9个上调，6个下调; 而在叶部则有10个上调，12个下调。57个大豆miRNA的表达不同程度地受低磷胁迫影响[54]，在低磷处理的大豆叶部与根部的sRNA文库中鉴定出属于35个miRNA基因家族的60个已知miRNAs与16个新miRNAs[55]。2013年，我们构建不同磷水平处理(磷充足与磷缺乏)大豆叶部或根部的sRNA文库，进行深度测序; 结合生物信息分析手段鉴定出25个miRNAs受低磷诱导，11个miRNAs受低磷抑制[52]; 此外我们通过降解组测序和RACE技术确定大豆miR399的靶基因是PHO2[52]，与拟南芥PHO2高度同源，也可能编码E2 结合酶。结合过去菜豆的研究，我们推测miR399/PHO2模块在豆科作物中作用是保守的，可能调节植物对低磷胁迫响应。

3.2miRNA在豆科植物氮营养胁迫中的功能

拟南芥miR167的靶基因ARF8编码转录因子，作为生长素信号通路成员促进侧根产生[56]。低氮条件下，miR167的表达下调，而ARF8表达上调，因此促进拟南芥侧根生长而增加根系吸收氮的能力[56]。Vidal等[27]报道，低氮条件上调miR393的表达，从而抑制AFB3的表达和拟南芥根系对生长素的敏感性，导致主根生长受抑制而侧根生长受促进，说明拟南芥通过miR393/AFB3的通路调节根构型的改变以适应低氮胁迫。miR169是植物中十分保守的miRNA，受低氮强烈下调，有些miR169成员的表达量在低磷的条件下也会减少[38-39]。miR169的靶基因在拟南芥和大部分植物中均属于HAP2基因家族，编码一类称作NF-YA亚基的转录调控因子[39]。研究证明，干旱胁迫降低miR169的表达，从而增强靶基因NF-YA5表达，增加拟南芥对干旱的适应能力[57]，说明miR169可能在氮胁迫和干旱胁迫交互响应方面起重要作用。

利用微阵列芯片技术，发现菜豆miR169的表达同时受到缺磷、 缺氮、 缺铁的抑制[47]。Wang等[58]通过高通量测序，对低氮敏感型No.84-70与低氮耐受型No.116大豆在缺氮情况下的miRNA变化进行鉴定，一共鉴定出362个已知的miRNAs与158个新的miRNAs。分析发现150个已知miRNAs与2个新的miRNAs受低氮的调控，暗示这些miRNA在大豆适应低氮胁迫中起重要的作用。揭示大豆miR169成员水平受低氮下调，也有成员受低磷下调[52]，表明miR169是调节氮磷养分平衡的重要成员。

根瘤菌能固定大气中氮气从而改善豆科作物氮营养。已有的研究证明，豆科作物miRNA在调节根瘤发育方面也起重要作用。如miR169在豆科植物根瘤发育的过程中起重要作用。在蒺藜苜蓿中过表达miR169或者敲除靶基因HAP2-1，均导致根瘤的不正常发育[59]。同样在蒺藜苜蓿中，miR166可以通过调节一个编码HD-ZIPⅢ的转录调控因子来控制根瘤菌的共生[60]。有研究者从蒺藜苜蓿成熟根瘤和根尖的sRNA文库中鉴定了36个保守的miRNAs与100个新的候选miRNAs，发现miR2586与miR107在根瘤分生组织中累积[61]。miR156调控miR172的表达，而miR172控制一个AP2类的转录因子的表达水平，此转录因子可能直接或间接控制非共生相关的血红蛋白的表达，此类血红蛋白可能是调节根瘤发育所必需的[62]。与此一致的是，过表达miR172能促进转基因大豆毛根的根瘤数目，促进共生有关的豆血红蛋白(leghemoglobin)和非共生相关的血红蛋白(hemoglobin)蛋白基因的表达，且转基因大豆根瘤中固氮酶活性(nitrogenase)比较高，说明miR172是根瘤发育的正调控因子。miR172在菜豆根瘤中有较高的表达量，在锰(manganese，Mn)毒害生长条件下，菜豆根瘤中的miR172表达增加，而靶基因AP2表达下降，暗示miR172在根瘤响应锰毒方面起重要作用[47]。大豆miR160也参与生长素调节根瘤发育。拟南芥miR160的靶基因为生长素响应因子基因家族成员ARF10/ARF16/ARF17[63-64]，过表达大豆miR160的毛根对生长素高度敏感，而对细胞分裂素不敏感，由此抑制了大豆根瘤的发育[65]。Li等[66]在大豆中异位过表达miR482，miR1512，miR1515能增加大豆根瘤的结瘤数。百脉根miR171通过调节靶基因NSP2来控制根瘤菌的侵染。miR397与它的靶基因—一个编码漆酶铜蛋白基因家族的成员可调节根瘤的固氮能力[67]。

Subramanian等[68]在2008年鉴定出35个miRNAs可能参与大豆早期根瘤的发育。Wang等[69]从大豆成熟根瘤中鉴定了22个已知miRNAs与4个新的miRNAs，发现了11个miRNA基因家族参与根瘤后期发育。最近研究发现，在正常与盐害生长条件下的大豆成熟根瘤中，有104个miRNAs表达水平受盐害的强烈影响，这暗示这些miRNA在大豆氮营养与盐害的信号互作方面起作用[70]。

3.3miRNA在豆科植物其他营养胁迫中的功能

3.3.1 硫响应miRNA在低硫胁迫条件下，拟南芥miR395表达水平增加[71]。APS1、 APS3和APS4以及硫转运子基因(SULTR2; 1)是miR395的靶基因。miR395主要在韧皮部伴胞表达[71]，而SLIM1是EIL类转录调节因子，它在低硫条件下促进miR395的表达。因此SLIM1是乙烯信号和硫营养信号互作的节点[72]。利用深度测序的技术手段，在大豆与菜豆中也发现了miR395[73-75]，暗示豆科作物miR395也可能调控植物适应低硫胁迫，但需要更深入研究。

3.3.2 铁响应miRNA通过微阵列芯片和Northern杂交，菜豆miR167、miR397、miR398 和miR408表达水平对铁亏缺作出响应，如铁饥饿抑制miR397和miR398表达[76]，而miR397和miR398的靶基因是编码含铜蛋白基因。这说明铁营养和铜营养平衡间的联系。此外，菜豆中pvu-miR1511、gma-miR1513、gma-miR1515和gma-miR1516在缺铁的情况下强烈表达，说明这些miRNA是菜豆铁营养胁迫响应的重要调节者[47]。菜豆中miR398与miR408在氮缺乏或铁缺乏的条件下，表达量下调，同时菜豆体内的铜含量增加[47]。

3.3.3 铜响应miRNA近年来的研究表明，拟南芥miR397、miR398、miR408以及miR857通过下调编码含铜蛋白基因的表达来适应低铜胁迫[77]。转录调控因子AtSPL7(SQUAMOSApromoterbindingprotein-like7)调节miR397、miR398、miR408和miR857的表达，而AtSPL7可直接结合miR398基因启动子的GTAC元件[78]。以上研究说明，miRNA基因在转录水平上也受到严格调控。深度测序结果表明，大豆基因组存在miR398、 miR397以及miR408等miRNA基因[52]。至于豆科作物是否存在类似的调控机制还有待深入研究。

3.3.4 其他养分胁迫或重金属响应miRNAZeng等[79]以野生大豆为材料，通过深度测序，鉴定了铝(aluminum)毒胁迫响应的miRNAs，发现miR396、miR390、miR1510a-5p受铝毒上调，而miR156、miR164与miR169则受铝毒下调。蒺藜苜蓿iR160、miR319、miR396、miR1507、miR1510a、miR390受铝毒下调表达[80]。

在高锰胁迫下，11个菜豆miRNAs在根瘤强烈表达，11个在根部或叶部受显著抑制[47]。此外，蒺藜苜蓿miR160，miR166，miR319，miR393，miR398对汞(Hg)，钙(Ca)及铝胁迫均有响应[81]。

图2总结了近年来豆科植物养分胁迫响应miRNA及其靶基因。需要指出的是，虽然上述研究揭示了一些对不同养分胁迫有响应的豆科植物miRNA， 但理解这些miRNA和靶基因的功能还需要进行深入细致的研究。

4　展望

虽然豆科作物中存在一些保守的养分胁迫响应miRNA，但我们对其功能的理解还很肤浅，因此对豆科作物养分胁迫响应miRNA的个体功能研究依然是今后研究的主要方向。如菜豆、 大豆等豆科植物中均鉴定出受低磷诱导的保守miR399，并且通过实验证明了miR399的靶基因也十分保守，均是编码泛素结合酶的基因PHO2[46,52]。但Xu等[52]通过生物信息学分析预测并结合5′RACE的手段证实大豆磷转运子基因GmPT5是miR399靶基因。这暗示大豆miR399参与磷营养胁迫响应的机制可能比拟南芥和水稻更复杂。

图2　豆科响应养分胁迫的miRNAs示意图Fig.2　Nutrient stress responsive miRNAs in legume

[注(Note): 图中圆圈表示养分胁迫，方框表示miRNAs，实线表示诱导，虚线表示抑制Circlesmeanthenutrientsstresses,boxesmeanmiRNAs,fulllinesmeanresponseanddashedlinesmeaninhibition.P—缺磷Phosphorusdeficiency;N—缺氮Nitrogendeficiency;Fe—缺铁Irondeficiency;Ca—钙胁迫Calciumtoxicity;SULTR—硫转运子Sulphatetransporter;PT—磷转运子Phosphatetransporter;TF—转录因子Transcriptionfactor.]

需要指出的是，一些豆科植物特异的miRNA调节根瘤的生长发育[61,66]。但是，目前对于这些特异的miRNA所调控的靶基因功能认识非常肤浅。因此根瘤菌侵染早期响应的豆科植物根系miRNA的功能也应该是今后研究方向之一。

miRNA基因本身是如何受到调节的还不清楚，因此对调节豆科作物养分相关miRNA表达的转录因子开展深入研究将会加深对miRNA功能的理解。靶基因模拟(Targetmimicry)是近年发现的一种调节miRNA活性的现象。拟南芥IPS1被证明作为miR399的拮抗者抑制miR399的功能[50]。还有一些miRNA的内源靶基因替身(targetmimics)已经被发现[82]。这些现象说明，miRNA自身既受到转录水平的调控也受到转录后的调节。研究豆科作物miRNA的转录调节和转录后调节，将有助于更进一步的理解miRNA的调控网络。一个miRNA前体可以产生几种成熟的miRNA，这个过程是受什么机制调节还不清楚，因而养分胁迫如何影响miRNA的产生量及产生种类值得研究。此外，一个miRNA可能对不同的营养胁迫均有响应，如miR156、miR169、miR171、miR172、miR397、miR398等受到不同的养分胁迫调控(图2)，暗示豆科作物中响应多种胁迫的miRNA可能是养分互作网络的关键节点。显然构建豆科作物miRNA调控营养胁迫响应的分子网络，将促进我们对miRNA调节养分胁迫响应和营养平衡功能的解析。

可以预期的是，揭示豆科作物养分胁迫响应miRNA及其调控网络将会极大促进我们对作物养分高效吸收利用机理的理解，对其中关键miRNA及其靶基因进行遗传操作将有可能培养或创制营养高效的豆科作物品种，以减少农业生产中肥料的投入。

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AdvancesonthestudyofmicroRNA-mediatedresponsestonutrientstressinlegumecrops

XUFeng,WANGJin-xiang*

(State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources/College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

MicroRNA(miRNA)isonekindofnon-codingsmallRNA(sRNA),andhas20-24nucleotidesinlength,andplaysimportantrolesinplantgrowthdevelopmentandinresponsetobioticandabioticstress.ManyevidenceshaveshownthatmiRNAiscrucialmodulatorinadaptationsofplanttonutrientstress.Legumeplantscouldfixnitrogenfromatmosphereandprovideproteinsaswellasedibleoilforhumanbeing.Nutrientstressesinsoilsobviouslyinhibitlegumegrowthanddevelopment,andresultinadecreaseinyield.Inpastdecades,moststudiesonmediationrolesofmiRNAinresponsestonutrientstressesinArabidopsisandricehavebeencharacterized,respectively.However,recentstudieshavewitnessedemergingreportsonthefunctionsofmiRNAinresponsetonutrientstressinlegumes,andrevealedcrucialrolesofmiRNAsinadaptationsoflegumestovariousadversenutrientconditionsviamodulatingactivityoftargetgenessuchassensingalterationofnutrientstatusandfine-tuningnutrienthomeostasis.Inthisreview,theregulationroleofmiRNAsinresponsetodifferentnutrientstresseswasreviewed,especiallyinresponsetothestressesfromphosphorus(P),nitrogen(N),sulphur(S),iron(Fe),copper(Cu)deficienciesandcalcium(Ca)toxicity,andthemechanismsofmiRNAsinvolvedintheadaptationsoflegumetodifferentkindsofnutrientstresswerediscussed,andtheperspectiveofresearchonnutrient-relatedmiRNAinlegumewasoutlinedinthenearfuture.

miRNA;nutrientstress;legumecrops

2014-09-02接受日期: 2014-10-10网络出版日期: 2015-07-02

农业部转基因专项(2014ZX0800928B); 科技部重大基础研究专项基金973项目(2011CB100301)资助。

徐锋(1986— )， 男， 广东云浮人， 博士研究生， 主要从事植物营养分子生物学方面的研究。E-mail:june92634@126.com

E-mail:jinxwang@scau.edu.cn

Q945.12;S565.1

A

1008-505X(2016)01-0236-09