洛阳地区常见嗜尸性丽蝇的CO I序列分析

赵琳琳，翟仙敦，张 振，吕 宙，夏志远，莫耀南

·法医学·

洛阳地区常见嗜尸性丽蝇的CO I序列分析

赵琳琳1，翟仙敦1，张 振1，吕 宙2，夏志远1，莫耀南1

目的 应用多态性较高的线粒体细胞色素C氧化酶辅酶I(CO I)对洛阳地区常见丽蝇科嗜尸性蝇类大头金蝇和丝光绿蝇进行序列分析，以期为嗜尸性蝇类的分子鉴定提供依据。方法 收集洛阳地区常见大头金蝇和丝光绿蝇标本8只，经形态学分类鉴定后，Chelex-100法提取样本DNA，扩增目的片段后测序，使用相应软件对所得序列分析，建立种内及种间进化分歧率，并构建系统发育树。结果 8个样本扩增获得CO I的长度为647 bp，CO I种间平均进化分歧率0.116，种间范围0.114～0.117，种内范围0～0.002。结论 CO I基因可以较好区分所涉及的蝇种，获得的基因序列是蝇类基因库的有益补充。

辅酶I；嗜尸性蝇类；双翅目丽蝇科；序列分析；法医昆虫学

利用嗜尸性蝇类进行死亡时间推断，已被法医学界广泛认可[1-2]。尸体上常见的双翅目(Diptera)蝇类一直是研究的热点，尤其是丽蝇科[3-7]。成虫的形态学鉴定相对容易，卵和幼虫却很难区分，且由于不同地区生活的嗜尸性蝇类种类有所不同，对于非昆虫专业的法医工作者来说，嗜尸性蝇类种属鉴定，始终有一定难度[2,7-8]。分子生物学技术不断地发展，给这一研究领域开辟了很多新途径。作者选择多态性较好的线粒体细胞色素C氧化酶辅酶I(coenzymeⅠ，CO I)基因对洛阳地区常见丽蝇科嗜尸性蝇类大头金蝇和丝光绿蝇进行序列分析和种属鉴定，以期为嗜尸性蝇类的分子鉴定基因库提供有益补充，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 蝇类样本采集 诱捕采集放置于河南科技大学操场树林下大鼠尸体上的大头金蝇和丝光绿蝇各4只。EP管分类单独密封包装置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2 DNA提取 取样本双前腿，清洗、捣碎，用Chelex-蛋白酶K法提取腿部DNA，置-20 ℃保存备用。

1.3 PCR扩增 采用线粒体CO I基因通用引物，目的片段长度约为700 bp，引物序列[9]见表1。总体系10 μL，内含10×PCR缓冲液(含Mg2+的)1 μL，dNTP混合物(2.5 mmol·L-1)1.2 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，5 U·μL-1的TaKaRa Ex Taq®DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板(含10～20 ng DNA)1.2 μL，ddH2O补足体系。PCR循环参数为94 ℃ 1 min；94 ℃ 1 min，45 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1.5 min，共5次循环；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，共35次循环；72 ℃ 8 min。

表1 线粒体CO I基因通用引物

1.4 电泳检测及测序分析 PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳(120 V，30 min)，溴化乙锭染色，电泳后置于凝胶成像系统拍照分析。测序引物为PCR扩增引物，扩增产物由上海立菲生物技术有限公司测序，正反链双向测序以保证序列的准确性。应用Chromas Version 1.62序列分析软件将所测8个样本基因序列进行整理，GenBank中作BLAST进行序列比对搜索，然后用MEGA7.0软件包按邻近法(neighbor-joining，NJ)对序列进行碱基组成、进化分歧率和系统发育树分析[10]。

2 结果

2.1 蝇种基因组提取及测序结果 本次实验共获得丽蝇科金蝇属大头金蝇和绿蝇属丝光绿蝇各4个样本的DNA，扩增片段核苷酸长度在700 bp左右，经过分析软件去除杂带和引物后，剩下的核苷酸片段长度为647 bp。BLAST结果表明实验样品与GenBank中已知序列相似度大于99%，与形态鉴定结果相符合，见表2。

表2 8 个丽蝇科样本线粒体CO I基因序列在线BLAST比对结果

注：Chrysomya：金蝇属；C. Megacephala：大头金蝇；L.sericata：丝光绿蝇。

2.2 碱基组成差异分析 对8例蝇类成虫样本的CO I基因进行序列分析，结果显示：保守位点593个，可变位点54个，其中简约性信息位点54个，自裔位点0个。碱基平均组成为：A=30.4%，G=15.9%，C=15.3%，T=38.4%，A+T =68.8%，具有明显的A+T倾向性。

2.3 发育树分析 运用MEGA7.0软件包对上述各种蝇类线粒体CO I基因序列进行分析，构建系统发育树，结果按照不同属种分别聚类，分子鉴定结果和形态学鉴定结果一致,见图1。在丽蝇种的级别上，自上而下形成了鲜明的2个群聚，分别包括4只大头金蝇和4只丝光绿蝇，支持率分别为100%和72%，效果较好；4只丝光绿蝇分聚为2小支，种间划分清晰。

注：图中右侧依次显示为蝇种名称、样本编号，左侧分支上的数字表示群聚的支持率(%)，图左下方为标尺，表示0.01进化距离的长度。C. Megacephala：大头金蝇；L.sericata：丝光绿蝇。图1 基于8 只样本线粒体CO I基因序列构建的NJ发育树

2.4 种内及种间进化分歧 经计算获得丽蝇科大头金蝇和丝光绿蝇共8个不同个体的遗传距离，2蝇种平均进化分歧率0.116，种间范围0.114～0.117，种内范围0～0.002，种间差异和种内差异没有交叉，见表3。

表3 8个样本线粒体CO I基因序列进化分歧表

注：序号1～4：大头金蝇；序号5～8：丝光绿蝇。

3 讨论

只有对嗜尸性蝇类种属做出准确鉴定，才能根据该种蝇类的生活特性推断个体死后间隔时间(postmortem interval,PMI)[11-12]。传统的嗜尸性蝇类形态学种属鉴定要求具有丰富的昆虫学经验，鉴于案发现场提取的样本蝇类多样性和复杂性，对于非昆虫专业人员很难从嗜尸性蝇类形态学鉴定其种属。

本次实验共获得丽蝇科大头金蝇和丝光绿蝇8个蝇类个体的DNA样本，扩增并测序后，经 BLAST在线比对表明实验样品与GenBank中相应蝇种已知序列相似度大于99%，分子鉴定结果与形态鉴定结果一致；对上述蝇类mtDNA上CO I基因序列进行分析，在丽蝇种的级别上形成大头金蝇和丝光绿蝇2个群聚，支持率分别为100%和72%，种间划分清晰，效果较好；本实验中2个蝇种平均进化分歧率0.116，种间范围0.114～0.117，种内范围0～0.002，种间差异和种内差异没有交叉。结果表明，洛阳地区常见丽蝇科嗜尸性蝇类大头金蝇和丝光绿蝇的线粒体CO I(647 bp)序列能较好地对大头金蝇和丝光绿蝇种类进行鉴别，且种内差异小。因此，可以根据mtDNA中CO I基因序列的差异鉴定不同的苍蝇个体是否同种，这与国内相关研究结果一致[13-15]。但由于各研究采用了不同的目的基因，即便是相同的基因也分属于不同的片段，这就对昆虫学分子鉴定的研究提出了更高的要求，可以考虑建立类似人类遗传标记的蝇类标准化数据库，便于共享和查询相关的数据信息。

总之，本研究表明洛阳地区常见丽蝇科嗜尸性蝇类大头金蝇和丝光绿蝇的线粒体CO I(647 bp)序列能较好地对大头金蝇和丝光绿蝇种类进行鉴别，而且种内差异小。因此，可以根据mtDNA中CO I基因序列的差异鉴定不同的苍蝇个体是否同种，为法医学实践服务，而且获得的基因序列也是嗜尸性蝇类基因库的有效补充。并且，还可与形态学鉴定互为补充，对死亡时间和死亡现场的推断分析具有较高的实用价值。

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CO I Sequence Analysis of Common Calliphoridae Necrophagous Flies from Luoyang

ZHAO Lin-lin1, ZHAI Xian-dun1, ZHANG Zhen1, Lv Zhou2, XIA Zhi-yuan1, MO Yao-nan1

(1.School of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.School of criminal investigation, Southwest University of Political Science and Law, Chongqing 400031,China)

ObjectiveTo analyze the common Calliphoridae flies from Luoyang by high polymorphisms of mtDNA CO I gene for identifying the species of necrophagous flies.MethodsEight flies including C. Megacephala and L.sericata were collected and classified by entomologists with traditional morphological characteristics. The DNA of flies was extracted with Chelex-100 method. The fragments of CO I were amplified and sequenced. All the sequences were analyzed by related software packages for nucleotide composition, genetic distance computation and phylogenetic tree construction.ResultsThe result of amplification with 8 samples showed that length of the obtained CO I sequences were 647 bp. The interspecific difference in CO I ranged from 0.114 to 0.117 with an average of 0.116, while the intraspecific difference was 0 to 0.002.ConclusionThe results indicated that congeneric species could be separated by CO I gene, which could be a supplement of necrophagous flie gene pool.

coenzyme Ⅰ；necrophagous flies；Diptera Calliphoridae；sequence analysis；forensic entomology

1672-688X(2016)04-0286-03

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.015

河南省基础与前沿课题(112300410082) 河南科技大学基金(09001309，13000914，13000696)

2016-09-26

1.河南科技大学法医学院，河南洛阳 471003 2.西南政法大学刑事侦查学院，重庆 400031

赵琳琳(1991-)，女，河南安阳人，从事法医物证和法医昆虫学研究。

翟仙敦，女，博士，副教授，E-mail：xiandunzhai@163.com

Q969.453.2;D919.4

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