膀胱尿路上皮癌与正常尿路上皮组织LncRNA表达谱差异性的研究

罗华荣，刘昭辉，吴登龙，洪　哲，赵　鑫，王天如

(上海市同济医院，上海　200065)



膀胱尿路上皮癌与正常尿路上皮组织LncRNA表达谱差异性的研究

罗华荣，刘昭辉，吴登龙，洪哲，赵鑫，王天如

(上海市同济医院，上海200065)

目的利用基因芯片技术，检测人膀胱尿路上皮癌与正常膀胱组织之间LncRNA表达谱的差异，对差异表达的LncRNA进行分类汇总，分析其生物学信息。方法取人膀胱尿路上皮癌组织与配对的癌旁正常组织3对。分别提取尿路上皮癌组织及正常癌旁组织的总RNA并纯化RNA，与人LncRNA芯片杂交。使用Agilent Genespring GX (Agilent)软件分析尿路上皮癌组织及正常癌旁组织的LncRNA表达情况。结果人膀胱尿路上皮癌组织与配对的癌旁正常组织的LncRNA表达谱差异明显。以P<0.05, 上调或下调信号差异大于2倍变化为标准,与正常膀胱组织比较，共筛选出差异表达基因1 122个，其中上调基因734个，下调基因388个。结论膀胱尿路上皮癌的发生发展是一个涉及多基因调控、多条染色体参与的复杂过程。所获得的膀胱癌差异表达LncRNA，尤其差异表达明显的上调基因AK124776、lincRNA-RAB12-1、KRT8P25、RP11-474J18.4、AC000110.1、KRT8P13、KRT8P10、BC072678等、下调基因nc-HOXB9-206、RP11-160A10.2、nc-HOXA11-86、nc-HOXD10-7、nc-HOXB9-205、CES4、nc-HOXD12-3等，考虑上述上调、下调基因对于膀胱癌发生的分子机制及膀胱癌的临床早期诊疗具有重要意义。

LncRNA;基因芯片;膀胱;尿路上皮癌;表达谱

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.07.015

膀胱恶性肿瘤是泌尿系统最常见的肿瘤之一，全球范围内占恶性肿瘤发病率的第9位[1]，其病理类型包括尿路上皮细胞癌(urothelial carcinoma，UCC)，腺细胞癌，鳞状细胞癌等，其中UCC是最常见的病理类型。膀胱肿瘤的治愈与否完全取决于是否能够早期预防、早期诊断、早期治疗，所以寻找合适的敏感性高、特异性强的肿瘤标志物成为了我们研究的重点。

近年来随着分子生物学的发展，人们对UCC发生发展过程中的细胞和分子水平的变化有了更深刻全面的认识，并进行了大量研究试图探讨UCC发生的分子和细胞机制，寻找膀胱肿瘤的特异性标志物。UCC发生发展的许多环节尚不能用单一的分子或基因变化来解释，UCC的发生和发展涉及复杂的，多步骤的及多种基因的参与过程。至今发现并报道可能和膀胱肿瘤有关的标志物包括DNA甲基化标志物、mRNA标志物、细胞因子或蛋白质标志物[2-17]。虽然如此，但是尚未找到膀胱肿瘤特异性标志物。近几年发现的非编码RNA(LncRNA)同样也参与肿瘤的发生和发展，其中长链非编码RNA(LncRNA)是一种长度大于200 nt，但不具备编码蛋白质功能的基因转录产物。相较于小分子RNA(microRNA)，LncRNA仍较陌生，也是目前非编码RNA的研究热点[17]。但LncRNA在膀胱癌中的作用机制仍不清晰。本研究使用基因芯片这一先进手段，以正常膀胱黏膜组织为对照，对膀胱尿路上皮癌的非编码长链RNA(LncRNA)基因表达谱变化进行研究，为进一步探讨LncRNA在膀胱肿瘤的作用提供一定的帮助，试图从LncRNA的角度去寻找膀胱肿瘤的特异性基因。

1　材料与方法

1.1一般资料膀胱癌组织与配对的癌旁组织3对,来自2012年3～4月在我科进行手术的膀胱癌患者，膀胱癌组织经病理证实为尿路上皮癌,癌旁组织经病理证实为正常膀胱组织。所有组织标本手术切除后，迅速放入液氮中冷冻。后标号储存于-80 ℃冰箱中备用。患者均为男性，患者及标本的一般情况见表1，癌细胞免疫组织化学见表2。

表1UCC患者及其肿瘤一般情况

序号样本号性别年龄(岁)病理分级(WHO1973)临床分期(UICC)肿瘤体积(cm)肿瘤数目癌旁组织样本号1B93T男541级T11.0×2.21B93C2B95T男651级T10.8×1.31B95C3B98T男633级T32.0×2.23B98C

WHO ：世界卫生组织；UICC：国际抗癌联盟。

表2癌细胞免疫组化

样本免疫标记CK广CK7P63P53Ki-67CD44CK20B93T+++++(5%)+(少量)+(部分)B95T++++(部分)+(10%)+(部分)+B98T++++---

Trizol试剂盒为Invitrogen公司产品，人LncRNA芯片 8×60 k(Arraystar公司)，杂交盒 (Agilent公司)，单色标记试剂盒 (Agilent公司)，基因表达杂交试剂盒(Agilent公司)，Baseline-zERO Dnase(Epicentre公司)，RNeasy Mini试剂盒(Qiagen公司)，RNeasy Mini Kit(Qiagen公司)，Agilent Micmarray scanner扫描仪均为Agilent公司产品。Agilent Feature Extraction (FE) 软件(Agilent 公司)。Genespring GX 分析软件(Agilent公司)。

1.2样本RNA的提取每50～100 mg组织样品，加入1 mL Trizol试剂，用电动匀浆器进行匀浆。匀浆后加入0.2 mL的氯仿分离，与异丙醇混合以沉淀其中的RNA。移去上清液，每1 mL Trizol试剂匀浆的样品中加入至少1 mL 75%乙醇，清洗RNA沉淀。去除乙醇溶液，溶解RNA时。

1.3RNA纯化及质控使用RNeasy spin column、无RNA酶的水洗涤RNA。用Agilent Nanodrop ND-1000测定A260、A280及A230的值并计算RNA 的浓度及纯度。用甲醛变性凝胶电泳观察RNA 5S、18S及28S的完整性。

1.4标记及杂交使用单色标记试剂盒，RNeasy Mini试剂盒等标记样本，使用NanoDrop ND-1000检测cRNA产量和特异活性并标记。使用人8×60 k的LncRNA芯片，杂交盒，基因表达杂交试剂盒在标准条件下将其杂交。

1.5芯片洗涤预热足够体积的基因表达洗涤缓冲液，室温下将基因表达洗涤缓冲液1注满滑动染色碟。洗涤开始后加入预热的(37 ℃)基因表达洗涤缓冲液2进行洗涤。洗涤后立即扫描芯片，避免由于环境氧化对于扫描信号的影响。

1.6芯片扫描及数据分析将玻片装入玻片架上。 装入Agilent 扫描仪传送带并进行扫描。将实验结果转换成数据保存。采用Agilent Microarray Scanner(G2505B)扫描芯片，将Agilent Feature Extraction软件读出的荧光值导入Agilent Genespring GX (Agilent)软件中进行数据分析。数据经过标准化后得出实验组与对照组标记的信号比值(fold change)，即为该基因组在实验组与对照组中变化情况。最后经过t-test检验，筛选出fold change≥2的基因为表达显著上调基因，Fold change≤0.5为表达显著下调基因(所有差异性基因均满足P<0.05)。

2　结　果

6张芯片杂交结果经软件分析筛选，每张芯片有效杂交率均达到99%以上，分析各芯片质量控制探针信号，认为6张芯片杂交检测的一致性高，结果可信。如图1所示。

图1芯片杂交结果分析

A:B93C;B:B93T;C:B95;D:B95T;E:B98C;F：B98T。

2.1芯片杂交结果的聚类分析收集6对样品有效表达基因检测的Ratio值，采用Cluster软件进行系统聚类分析(图2)，图形显示差异生物标记物表达基因的信号强度，颜色表示信号值的强度，由粉色-红色，信号值依次增加，红色-绿色代表高表达，蓝色-粉色代表低表达。

图2　6组芯片杂交结果聚类分析

2.2芯片杂交信号散点图散点图能直观反映肿瘤组与对照组之间LncRNA差异表达的变化程度。经数据均一化处理后构建散点图(图3)。图中上方绿线上方区域是2倍以上上调的差异表达的lncRNA，下方绿线下方区域是2倍以上下调的差异表达lncRNA。

图3　芯片杂交信号散点图

上方绿线的上方区域以及下方绿线的下方区域是2倍以上的差异表达。

2.3LncRNA 差异表达结果通过将3例癌组织的基因表达谱分别与对照组的基因表达谱进行对比研究。结果显示，膀胱癌组与对照组相比，以P<0.05、 上调或下调信号差异大于2倍变化为标准,与正常膀胱组织比较，共筛选出差异表达基因1 122个，其中上调基因734个，下调基因388个。分别例举上调和下调10倍以上的LncRNA(表3、表4)。差异表达LncRNA染色体分布(图4)。

表3膀胱尿路上皮癌上调10倍以上差异表达LncRNA

序列名称基因名称色谱上调倍数类型探针名称uc003cmy.1AK124776chr326.29291非编码RNAASHG19A3A022520C20652lincRNA-RAB12-1chr1818.844774非编码RNAASHG19A3L0003342AK000839/chr1716.210579非编码RNAASHG19A3A008508ENST00000473150KRT8P25chr315.875776非编码RNAASHG19A3A022860ENST00000512863RP11-474J18.4chr515.131286非编码RNAASHG19A3A027163ENST00000431957AC000110.1chr715.049078非编码RNAASHG19A3A035014ENST00000463294KRT8P13chr314.981011内含子 反义转录RNAASHG19A3A023526ENST00000450021KRT8P10chr214.825374非编码RNAASHG19A3A014732uc001rjo.1BC072678chr1214.747757非编码RNAASHG19A3A048481ENST00000448540RP11-111E2.1chr914.659423内含子 反义转录RNAASHG19A3A038816ENST00000504509RP11-789C1.1chr414.507504非编码RNAASHG19A3A026300ENST00000414328RP11-110J1.3chr114.4582815非编码RNAASHG19A3A032876ENST00000399149SFRS9P1chr2114.17717非编码RNAASHG19A3A018851ENST00000449217RP3-452M16.1chrX14.110057非编码RNAASHG19A3A040138ENST00000413425KRT8P18chr313.99092非编码RNAASHG19A3A020870ENST00000440275KRT8P7chr1113.342168非编码RNAASHG19A3A045784ENST00000451609RP11-543F8.1chr1013.288165非编码RNAASHG19A3A042424EC495588lincRNA-RCN2chr1512.822171非编码RNAASHG19A3L0002752ENST00000367074GS1-309P15.4chrX12.674266非编码RNAASHG19A3A040786ENST00000424882GS1-309P15.3chrX12.63172非编码RNAASHG19A3A039699ENST00000485873RP4-621B10.3chr112.627898非编码RNAASHG19A3A048157ENST00000398745KRT8P26chr1112.41178非编码RNAASHG19A3A046607ENST00000511504RP11-790I12.1chr412.265042非编码RNAASHG19A3A025622nc-HOXB4-176+nc-HOXB4-176chr1712.118851非编码RNACUST_54_PI426075208ENST00000454391AL358913.1chr1411.904219非编码RNAASHG19A3A050730ENST00000497538RP11-111F10.2chr311.498124非编码RNAASHG19A3A023430ENST00000392131AC079305.6chr211.317965非编码RNAASHG19A3A016645ENST00000510090RP11-618I10.2chr411.099051非编码RNAASHG19A3A025620ENST00000434750AC108171.5chrX10.894489非编码RNAASHG19A3A041704ENST00000453086RP5-1091N2.3chrX10.1777935非编码RNAASHG19A3A040026

表4膀胱尿路上皮癌下调10倍以上差异表达lncRNA

续表4

序列名称基因名称色谱下调倍数类型探针名称AK026384chr226.26481非编码RNAASHG19A3A016486nc-HOXB9-205-nc-HOXB9-205chr1725.701212外显子ASHG19A3H0000076ENST00000421606CES4chr1624.578844非编码RNAASHG19A3A054608nc-HOXD12-3-nc-HOXD12-3chr221.637152外显子ASHG19A3H0000174uc002tjx.3AY343891chr220.35203非编码RNAASHG19A3A014229ENST00000416700RP11-58A12.3chr917.737352非编码RNAASHG19A3A038722AL109696chr1515.587008非编码RNAASHG19A3A052517uc010mam.2AF131817chr815.372687外显子ASHG19A3A035947uc003tcg.2AK124304chr715.336274外显子ASHG19A3A034154ENST00000442797AC007064.21chr2215.284027非编码RNAASHG19A3A020031AL390167chr1314.648443非编码RNAASHG19A3A049319ENST00000514910RP11-451F20.1chr414.038315非编码RNAASHG19A3A026355uc003xjb.2BC034319chr813.934998非编码RNAASHG19A3A036526CF129145lincRNA-LOC100506581-1chr1613.665986非编码RNAASHG19A3L0000894uc001awc.1AK055853chr113.640614反义转录RNAASHG19A3A012055AK125472chr1313.590306非编码RNAASHG19A3A049853uc001gla.1CR621436chr112.739795非编码RNAASHG19A3A035511uc004ags.1AK130904chr912.102253反义转录RNAASHG19A3A038744AF087976chr311.665831非编码RNAASHG19A3A022767G65639chr510.440295非编码RNAASHG19A3A026776AK307235lincRNA-SRD5A2chr210.403127外显子ASHG19A3L0001181ENST00000439715RP11-282E4.1chr910.397835非编码RNAASHG19A3A038699ENST00000434499RP11-145A3.4chr110.215157非编码RNAASHG19A3A040793

图4差异表达LncRNA染色体分布情况

3　讨　论

长链非编码RNA(Long non-coding RNA, LncRNA)是一类本身不编码蛋白、转录本长度超过200核苷酸的非编码RNA分子。LncRNA最初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明它可在多层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达。它参与了基因组修饰、转录激活、转录干扰、染色体沉默和修饰等过程[17]，目前其作用机制包括干扰下游基因表达、影响编码蛋白基因转入及调节蛋白质功能等[18]。随着对LncRNA研究的深入，证明LncRNA在泌尿系统肿瘤包括膀胱肿瘤的发生、发展中扮演着重要的角色，正常组织和肿瘤组织的LncRNA表达存在明显的差异[19]，而且在同一肿瘤的不同阶段LncRNA表达也存在明显的差异[20]。虽然其发挥的功能未被深入了解，影响肿瘤形成和进展的机制尚不清楚，但其将来潜在价值是不言而喻的。其中的大量LncRNA具有高度的保守性，存在特定的基因序列，在人类正常细胞和肿瘤细胞中都存在着广泛表达，有很多拷贝，分布在染色体的特定位点和肿瘤相关区域。某些LncRNA与膀胱肿瘤的发生发展关系密切，有助于将来膀胱肿瘤的预防、诊断和治疗。

本实验中，我们采用芯片技术将人膀胱尿路上皮癌和正常配对膀胱组织进行LncRNA表达谱筛查，两者LncRNA差异表达明显，所获得的差异表达LncRNA基因总共1 122个，包括上调和下调基因，而且各条染色体上均有分布，所以显而易见，膀胱尿路上皮癌的发生发展是一个涉及多基因调控、多条染色体参与的复杂过程。

目前本实验获得的差异表达明显(上调或下调显著)的LncRNA，检索文献尚无膀胱癌相关功能、机制方面报道，其可能对膀胱癌发生的分子机制及膀胱癌的临床诊疗具有重要的意义，需要更进一步的研究证实。变化显著的上调基因AK124776、lincRNA-RAB12-1、KRT8P25等、下调基因nc-HOXB9-206、RP11-160A10.2、nc-HOXA11-86等是研究的重点。也许其中就有膀胱癌特异性基因，帮助膀胱癌的预防、早期诊断、靶向治疗。

虽然芯片技术具有高敏感、高特异性的特点，但是目前LncRNA基因芯片价格昂贵，筛查例数少，今后需进一步扩大样本量，使筛查结果更具代表性。

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(编辑王玮)

Gene microarray analysis of LncRNA expression profile in human urothelial carcinoma of the bladder

LUO Hua-rong, LIU Zhao-hui, WU Deng-long, HONG Zhe, ZHAO Xin, WANG Tian-ru

(Tongji Hospital of Shanghai City, Shanghai 200065, China)

Objective To analyze the expression profile of LncRNA in normal urinary bladder tissue and bladder urothelial carcinoma, to gather and classify the differently expressed LncRNA, and to analyze the biological information. MethodsA total of 3 specimens of bladder urothelial carcinomas and 3 specimens of normal urinary bladder tissues were collected. Total RNA was isolated, purified and hybridized with human LncRNA. The expressions of LncRNA urothelial carcinomas and adjacent normal tissues were analyzed with Agilent Genespring GX (Agilent) software. ResultsThe expression profile of LncRNA was significantly different between normal urinary bladder tissues and bladder urothelial carcinomas. Compared with normal urinary bladder tissues, the bladder urothelial carcinoma had 1 122 differently expressed genes (P<0.05), of which 734 were upregulated and 388 were downregulated. ConclusionsBladder urothelial carcinoma involves the regulation of multiple genes and participation of multiple chromosomes. Differently expressed LncRNA involve upregulated genes including AK124776, lincRNA-RAB12-1, KRT8P25, RP11-474J18.4, AC000110.1, KRT8P13, KRT8P10, BC072678 and downregulated genes including nc-HOXB9-206, RP11-160A10.2, nc-HOXA11-86, nc-HOXD10-7, nc-HOXB9-205, CES4, nc-HOXD12-3 and so on. Further research into these LncRNA will help to clarify the mechanism of bladder urothelial carcinoma, and to guide the early diagnosis and treatment.

LncRNA; gene microarray; urinary bladder; urothelial carcinoma; expression profile

2016-01-14

2016-03-04

国家自然科学基金资助项目(No.81172426)；上海市教委创新重点项目(No.12ZZ034)

王天如，副主任医师.E-mail：tj6611@sina.com

罗华荣(1980-)，男(汉族)，医学硕士，主治医师.研究方向：膀胱肿瘤.E-mail:huarongluo8@sina.com.

刘昭辉(1987-)，男(蒙古族)，医学硕士，研究方向：前列腺肿瘤.E-mail:hui3579lina@163.com,系共同第一作者.

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