膀胱癌BIU-87细胞靶向超声纳米脂质微泡造影剂的制备及体外超声成像

苏西西，杨晓峰，张　帆，罗　芳，贾　凡，李宏州，潘　佐

(1.山西医科大学第一临床医学院，山西太原　030001；2.山西医科大学第一医院泌尿外科，山西太原　030001；3，山西医科大学免疫教研室,山西太原　030001；4.山西医科大学附属山西大医院泌尿外科，山西太原　030032)



·基础研究·

膀胱癌BIU-87细胞靶向超声纳米脂质微泡造影剂的制备及体外超声成像

苏西西1，杨晓峰2，张帆3，罗芳3，贾凡1，李宏州1，潘佐4

(1.山西医科大学第一临床医学院，山西太原030001；2.山西医科大学第一医院泌尿外科，山西太原030001；3，山西医科大学免疫教研室,山西太原030001；4.山西医科大学附属山西大医院泌尿外科，山西太原030032)

目的制备具有膀胱癌BIU-87细胞靶向结合的超声纳米脂质微泡造影剂，并观察体外靶向能力、检测其对细胞增殖的影响和体外超声成像效果。方法通过机械振动法制备纳米脂质微泡，用生物素-亲和素桥接法将NYZL1连接到纳米脂质微泡的表面制备靶向纳米脂质微泡造影剂，利用倒置显微镜观察其一般特性，Zate检测仪检测粒径大小和表面电荷，使用倒置显微镜来观察其体外靶向效果，用MTT法检测其不同浓度对细胞增殖的影响，使用超声诊断仪观察体外显影效果。结果膀胱癌BIU-87细胞靶向超声纳米脂质微泡呈圆形，分布均匀，无聚集；在体外靶向实验中，靶向纳米脂质微泡造影剂能高效特异性的结合在膀胱癌BIU-87细胞表面并沿细胞表面规则排列；不同浓度下两种微泡对细胞增殖无明显变化(P>0.05)；体外超声成像实验中，靶向纳米微泡呈点状细密高回声。结论本实验成功制备膀胱癌BIU-87细胞超声纳米脂质微泡造影剂，能够在体外与膀胱癌BIU-87细胞特异性地靶向结合，两种微泡对细胞生长无明显影响且体外超声显像效果良好。

纳米脂质微泡；膀胱癌；靶向超声造影剂；体外实验

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.07.014

靶向超声纳米脂质微泡作为一种新型、无创、靶向性的技术越来越引起人们的重视，一方面通过微泡聚集特点对肿瘤进行早期精准诊断[1]，另一方面借助微泡载体携带基因、药物进行靶向治疗[2]。随着膀胱导向肽的研制，加速了靶向膀胱肿瘤研究。罗俊茜等[3]利用噬菌体展示技术筛选膀胱癌靶向肽，获得与中国人膀胱癌BIU-87细胞系高度结合的CSSPIGRHC导向肽,命名为NYZL1，为膀胱癌的早期诊断和靶向治疗提供理论依据[4]。因此，随着纳米微泡技术及膀胱肿瘤导向肽的研究日益成熟，两者结合成为膀胱靶向纳米微泡，为膀胱肿瘤早期精准诊断及借助纳米微泡携带基因、药物等进行靶向治疗成为可能。

1　材料与方法

1.1材料、试剂泊罗沙姆124(太原市贝倍科贸易有限公司)、甘油(山西医科大学实验中心提供)、全氟丙烷气体(C3F8，天津晶明新技术开发有限公司)、磷酸盐缓冲液(PBS，武汉博士德有限公司)、亲和素(武汉博士德有限公司)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC，美国AVANTI公司)、生物素化二脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG(2000)Biotin，美国NANOCS公司)、生物素化NYZL(杭州中肽生化有限公司)、人膀胱癌BIU-87细胞株(北京大学泌尿外科研究所)等。仪器CO2恒温培养箱(赛默飞世尔科技公司)、Zate检测仪(太原理工大学提供)、YCD-EL259低温冰箱(中科美菱低温科技责任有限公司)、CKX41倒置光学显微镜(日本Olympus公司)、SC-04低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)、SHA-B恒温振荡器(常州国华电器有限公司)、UTP313电子天平(上海华抄电器有限公司)、YJT银汞胶囊调和器(上海医疗器械股份有限公司)、logicE9超声仪(山西医科大学第一医院超声科)等。

1.2普通纳米脂质微泡的制备及物理性质测定将9.61 mg DPPC和4.39 mg DSPE-PEG(2000)Biotin混合加入3 mL的西林瓶中，并加入1 mL的水化液(甘油和加入一定量泊洛沙姆124的PBS,体积比1∶9)，将混合的西林瓶放入37 ℃ 120 r/min恒温振荡器中30 min均匀混合，置于4 ℃冰箱冷却20 min，然后用全氟丙烷置换西林瓶中的空气并用封口膜使其密闭，银汞胶囊调和器夹住西林瓶，水平重复式超声机械振动，振动60 s，形成乳白色液体，4 ℃冰箱静置分层，弃去下清液，用PBS纯化微泡3次，收集中间层乳白色液体加入1 mL PBS,完成普通纳米脂质微泡制备。应用血球计数仪在光镜下测定微泡的浓度，利用倒置光学显微镜观察微泡颜色、分布、大小、形态，Zate的检测仪检测粒径大小、电位，4 ℃冰箱7 d、13 d光镜下观察。

1.3膀胱癌BIU-87细胞靶向纳米脂质微泡的制备及物理性质测定取上述200 μL普通纳米脂质微泡加入2 mL PBS与饱和量的100 μg亲和素置于4 ℃冰箱反应30 min，200 r/min离心2 min去下清液，PBS冲洗3次，置于4 ℃冰箱冷却20 min，收集中间层微泡，将所收集的微泡与饱和量的10 ug生物素化NYZL置于4 ℃冰箱反应30 min，200 r/min离心2 min去下清液，PBS冲洗3次，收集微泡，膀胱癌BIU-87细胞靶向纳米脂质微泡制备完毕。应用血球计数仪在光镜下测定微泡的浓度，利用倒置光学显微镜观察微泡颜色、分布、大小、形态，Zate检测仪检测粒径大小、电位，4 ℃冰箱7 d、13 d光镜下观察。

1.4细胞培养膀胱癌BIU-87细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，置于37 ℃、5%的CO2孵育箱培养，隔日传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.5靶向脂质微泡与普通微泡体外靶向膀胱癌BIU-87细胞实验取对数生长期膀胱癌BIU-87细胞接种于放置有盖玻片的6孔培养板中培养，待细胞培养至80%并将盖玻片细胞贴壁面放置在培养基上，分为4组。A组:取200 μL靶向纳米脂质微泡加入培养基中，常温下孵育30 min，用PBS冲洗细胞表面3次，光镜下观察靶向纳米脂质微泡与细胞结合情况；B组:取200 μL普通纳米脂质微泡加入培养基中，常温下孵育30 min，用PBS冲洗细胞表面3次，光镜下观察普通纳米脂质微泡与细胞结合情况；C组 预先将10 μg生物素化NYZL与细胞常温下共孵育30 min，取200 μL靶向纳米脂质微泡加入培养板中，常温下孵育30 min，用PBS冲洗细胞表面3次，光镜下观察靶向纳米脂质微泡与细胞结合情况；D组 预先将10 μg生物素化NYZL与细胞常温下共孵育30 min，取200 μL普通纳米脂质微泡加入培养板中，常温下孵育30 min，用PBS冲洗细胞表面3次，光镜下观察普通纳米脂质微泡与细胞结合情。

1.6MTT法检测不同浓度微泡对细胞增值的影响取96孔板，分A、B、C两组，收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μL,铺板使待测细胞调密度至5×103孔，边缘孔用无菌PBS填充。5%CO2，37 ℃孵育，24 h后至细胞单层铺满孔底, A组分别加靶向微泡0、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107(个/mL)各10 μL；B组分别加普通微泡(浓度同上)；C组分别加入相同量的PBS；之后放入5%CO2、37 ℃孵育。24 h后每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，继续培养4 h，小心用PBS冲2～3遍后，再加入含MTT的培养液，终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪A490 nm处测量各孔的吸光值，计算细胞相对存活率，细胞相对存活率%=(实验组A均值/对照组A均值)×100%。

1.7靶向纳米脂质微泡体外超声成像取1×107/mL靶向纳米脂质微泡5 mL注满橡胶塞封口的透明西林瓶，同时取5 mL无离子水注入同样规格的西林瓶中作为空白对照组。用logicE9超声仪进行实时成像(中心频率22 MHz超高频探头，机械指数为0.06)。

1.8统计学分析采用SPSS17.0统计分析软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示。A组、B组、C组对细胞的毒性作用均采用One-Way ANOVE,方差不齐则选用近似F检验Welch法进行方差分析，差异性检验水准为P<0.05(双侧)。

2　结　果

2.1普通纳米脂质微泡的物理特性普通纳米脂质微泡外观呈乳白色混悬液； 400倍镜下观察微泡分布均匀，无聚集，单个微泡外观呈圆形，浓度为3.5×109/mL(图1A)；Zate检测仪示粒径范围为321～559 nm，平均集中于466 nm，电位为-14.6 mV。室温下保存7 d，外观仍圆整，分布均匀，无聚集现象； 13 d微泡开始变大，大小不一，有集聚现象，分布不均(图1B)。

2.2靶向纳米脂质微泡的物理特性靶向纳米脂质微泡外观呈乳白色混悬液； 400倍镜下观察微泡分布均匀，无聚集，单个微泡外观呈圆形，浓度为2.1×109/mL(图1C)；Zate检测仪示粒径范围为337～683 nm，平均集中于582 nm，电位为-14.6mV。室温下保存7 d，外观仍圆整，分布均匀，无聚集现象； 13 d微泡开始变大，大小不一，有集聚现象，分布不均(图1D)。

图1光学显微镜下纳米脂质微泡变化(×400)

A、B:普通纳米微泡(1 d、13 d)；C、D:靶向纳米微泡(1 d、13 d)。

2.3MTT法检测不同浓度微泡对细胞增值的影响MTT结果显示3组均未明显抑制肿瘤细胞的生长(P>0.05，图2)，提示微泡不直接影响肿瘤细胞生长，且随着浓度的升高，A值变化不明显。

2.4靶向纳米脂质微泡与普通脂质微泡分组体外靶向实验A组靶向纳米微泡造影剂能高效特异性地结合在膀胱癌BIU-87细胞表面并沿细胞表面规则排列，见图3A；而B、C、D组未见微泡与膀胱癌BIU-87细胞明显结合，见图3B、3C、3D。

图2不同浓度下板孔的A值

图3　光镜下纳米脂质微泡与BIU-87细胞的结合(×400)

A:靶向纳米微泡与膀胱癌细胞的结合图；B:普通纳米微泡与膀胱癌细胞的结合图；C:预先将生物素化的NYZL1阻断后靶向纳米微泡与膀胱癌细胞的结合图；D:预先将生物素化的NYZL1阻断后普通纳米微泡与膀胱癌细胞的结合图。

图4　超声显像效果图

3　讨　论

膀胱癌居中国男性泌尿生殖系恶性肿瘤发病率第1位[5]，膀胱癌具有恶性程度高、复发率高等特点。准确早期诊断肿瘤及切实有效的治疗方法是提高患者生存率的关键因素。

本课题组前期利用体内噬菌体展示技术筛选膀胱癌特异性结合肽(NYZL1)并得到证实[6]，但其缺乏有效的载体；本研究通过机械振动法和生物素-亲和素桥接法制备出靶向膀胱癌的纳米脂质微泡造影剂NYZL1-NBs，即有效的靶向载体。该纳米微泡表面光滑，分布均匀，性质稳定，平均粒径集中于582 nm，理论上可以闯过病变血管间隙被动靶向肿瘤组织。体外靶向实验显示，膀胱癌BIU-87细胞能与NYZL1-NBs充分结合并沿细胞表面规则排列，而预先用生物素化-NYZL1与BIU-87细胞饱和结合后，细胞周围无NYZL1-NBs结合，结果表明NYZL1-NBs能与膀胱癌BIU-87细胞主动靶向结合。体外超声观察靶向纳米微泡超声显像明显。

与传统的微泡造影剂相比，纳米颗粒尺寸小、比表面积大，表面原子数、表面能和表面张力随粒径的下降急剧增大；表面原子周围缺少相邻的原子，有许多悬空键，具有不饱和性质，易与其他原子相结合而稳定下来，具有很大的化学活性[7]。由于纳米颗粒粒径小，易逃避体内网状内皮系统的清除作用，延长其在体内的循环时间，而利于细胞的摄取，从而使药物缓慢释放，维持一定的血药浓度，有效延长了药物持续时间，提高了药物效能，同时产生较少的代谢产物，减少身体其他部位的药物作用，大大减少副作用[8-9]。表面粘附或包裹药物、基因的纳米级微泡通过静脉进入体内，在超声显影后给予一定的高声压，微泡会发生瞬态热效应、机械效应和空化效应，致使微泡非对称的压缩、膨胀，最终破裂，从而达到药物治疗、基因转染的作用[10]。

综上所述，本实验成功制备膀胱癌BIU-87细胞靶向纳米脂质微泡超声造影剂，具有粒径均匀、性质稳定、无毒性、体外显影效果佳、靶向细胞能力强等特性，为下一步在体内移植瘤靶向显像诊断和载药靶向治疗研究提供重要的基础，有望进一步开拓超声在膀胱肿瘤中的诊断和治疗新领域。

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[3] 罗俊茜, 张帆, 杨晓峰, 等. 利用体内噬菌体展示技术筛选膀胱癌特异性结合肽[J]. 中国免疫学杂志, 2015, 31(4)：509-513.

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(编辑何宏灵)

Preparation of BIU-87 cells targeting nanobubbles as ultrasound contrast agent and imaging study in vitro

SU Xi-xi1, YANG Xiao-feng2, ZHANG Fan3, LUO Fang3, JIA Fan1, LI Hong-zhou1, PAN Zuo4

(1. the First Clinical Medical College, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001; 2.Department of Urology, First Hospital Affiliated to Shanxi Medical University, Taiyuan 030001; 3.Department of Microbiology and Immunology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001; 4.Department of Urology,Shanxi Dayi Hospital Affiliated to Shanxi Medical University, Taiyuan 030032, China)

Objective To prepare nanobubbles specifically targeting BIU-87 cells, and to observe the targeting ability and effect on cell proliferation and ultrasound imaging in vitro. MethodsMechanical vibration method was used to prepare non-targeting nanobubbles. The biotin-avidin bridge method was used to conjugate biotinylated NYZL1, and non-targeting nanobubbles linked to biotin-NYZL1 become targeted nanobubbles. The morphology, concentration and shelf life of nanobubbles were detected with optical microscope, and the particle size and surface charge were measured with Zate detector. The targeting ability was observed with microscope. The proliferation of cells was detected by MTT method. Ultrasound imaging was observed in vitro. ResultsThe targeted nanobubbles were successfully generated, which were round, evenly distributed, without aggregation. In targeted in vitro experiment, the nanobubbles attached to the surface of BIU-87 cells firmly and regularly arranged along the cell surface. There was no significant difference between different concentrations of nanobubbles on cell proliferation (P>0.05). In in vitro ultrasound imaging experiment, the targeted nanobubbles showed fine punctuate hyper echo. ConclusionThe targeted nanobubbles are successfully prepared, which can specifically target and attach to BIU-87 cells in vitro and their ultrasound imaging is fine.

nanobubble; bladder cancer; targeted ultrasound contrast agent; in vitro

2016-01-13

2016-03-04

国家自然科学基金(No.81172444)

杨晓峰, 主任医师, 教授. E-mail：yxfylq@163.com

苏西西(1989-), 男(汉族),硕士研究生.研究方向:膀胱肿瘤精准诊疗新技术. E-mail：2008101033@163.com

R737.14

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