钩藤中钩藤碱、异钩藤碱的提取与含量测定在预后中的应用分析

张　恒　饶坤林

(湖北省荆州市中心医院药学部，荆州，434020)



中药研究

钩藤中钩藤碱、异钩藤碱的提取与含量测定在预后中的应用分析

张恒饶坤林

(湖北省荆州市中心医院药学部，荆州，434020)

目的：探讨钩藤中钩藤碱、异钩藤碱的提取与含量测定在预后中的应用。方法：采取水煎液以及甲醇提取液的方式对钩藤中的钩藤碱及异钩藤碱进行提取，并使用高效液相色谱系统分别对其提取的含量进行测定。结果：在2.5～80 μg/mL的范围内钩藤碱的线性关系良好，此时的回归方程为Y=76.717 0X-0.072 7(r=0.999 8)，RSD<8.7%；在2.0～80 μg/mL的范围内异钩藤碱的线性关系良好，此时的回归方程为Y=87.472 9X-0.366 6(r=0.999 7)，RSD<7.3%。甲醇提取液的方式所提取钩藤碱和异钩藤碱的含量高于水煎液的方式，并且使用二十倍质量的甲醇量，24 h的冷侵时间以及60 min的超声时间最合适。结论：使用甲醇进行提取在用于钩藤中钩藤碱及异钩藤碱中作用优异，对其质量的控制性好，重复性高，操作方法简单，可提高预后，值得在临床上应用推广。

钩藤碱；异钩藤碱；提取方法

钩藤是一种传统中药，其种类众多，有钩藤、毛钩藤、大叶钩藤、华钩藤等，有15种，属于一种茜草科植物[1-2]。该药物的钩茎枝可以用来入药，具有降压、抗心律失常、镇静的作用，并且在老年痴呆症的治疗中也发挥着功效[3-4]。在钩藤中，钩藤碱和异钩藤碱这2种成分在药效上面的作用效果最大[5-6]。因此在对这2种成分的提取和测定上面有着十分重要的临床意义，此次我们应用了不同方式对钩藤中的钩藤碱及异钩藤碱进行了提取并对其含量进行了检测，现报道如下。

1　资料与方法

1.1仪器由美国DIONEX公司生产的高效液相色谱系统，Dionex summit型，其中包括色谱工作站Chromeleon，二极管阵列检测器PDA-100，柱温箱TCC-100，自动进样器ASI-100。美国Milipore公司生产的Milipore0.45 μm滤膜以及过滤器，日本shimadzu公司生产的AUM220D电子分析天平，上海安亭科学仪器厂生产的低速大容量离心机LXJ-IIB。

1.2受试药物钩藤碱对照品(纯度≥98%，批号150821，生产厂家：南昌被他生物科技有限公司)，异钩藤碱对照品(纯度≥98%，批号150902，生产厂家：南京贝塔生物科技有限公司)，甲醇(色谱纯，北京Dikma科技有限公司)，钩藤标准药材：广州市药品检验所。水为去离子水，由密理博纯水机Milli-Q型进行制备。

1.3方法

1.3.1色谱条件色谱柱选择Phenomenex C18柱，流动相中甲醇和水的比例为70∶30，0.5 mL/min的流速，30 ℃柱温，5 ℃进样器温度，245 nm的检测波长。

1.3.2对照品储备液的配置精密提取1.00 mg的钩藤碱标准对照品以及1.00 mg的异钩藤碱标准对照组，将其分别放置在1.0 mL的棕色容量瓶之中，然后加入60%的甲醇溶液进行摇匀，得出钩藤碱标准储备溶液1.00 mg/mL，异钩藤碱标准储备溶液1.00 mg/mL，然后放入冷冻箱内保存，注意避光。在使用前可用60%的甲醇进行稀释至所需要的浓度。

1.3.3样品的制备将钩藤药材使用2种方式进行制备：1)通过水煎液制备，将钩藤药材经过捣碎之后过20目筛，通过精密称取5 g的量，放入圆底烧瓶之中，再使用10倍质量的纯水将其浸泡40 min后，使用电热套进行加热，然后进行45 min的回流提取，之后冷却约15 min的时间，将滤液体积进行测量并记录。2)另一种方式使用甲醇提取液，将钩藤药材捣碎之后过20目筛，同样精密称取5 g的量，放入棕色瓶之中，精密加入甲醇，质量为钩藤药材的20倍，随后放入4 ℃的冰箱内将其冷浸24 h，并进行45 min的低温超声，将甲醇的重量补足后进行过滤，测量并记录滤液体积。将以上制备的2种滤液提取1.5 mL后放入离心管之中，通过10 000 r/min离心10 min后，加入0.45 μm的清液入微孔滤膜进行过滤，然后进行进样分析，分别按照各自最后剩下的“滤液体积”进行换算，换算后的含量为相同提取液体积下相等含量的药材的。

1.3.4标准曲线的制备通过精密吸取钩藤碱对照品1.0 mg/mL的标准液，分别置入7个1 mL的棕色容量瓶之中，分别为80、60、40、20、10、5、2.5 μL，再精密吸取异钩藤碱对照品1 mg/mL的标准液，同样放入7个1 mL的棕色容量瓶之中，为80、60、40、20、10、5、2.0 μL。然后使用60%的甲醇定容，分别对所有溶液进行10 μL的进样检测分析。结果显示，在2.5～80 μg/mL的范围内钩藤碱的线性关系良好，此时的回归方程为Y=76.717 0X-0.072 7(r=0.999 8)；在2.0～80 μg/mL的范围内异钩藤碱的线性关系良好，此时的回归方程为Y=87.472 9X-0.366 6(r=0.999 7)。

1.3.5检测限和定量限通过精密量去线性项下的对照品储备液进行定量的稀释，信噪比S/N的比值为3∶1，结果显示钩藤碱的检测限为0.25 μg/mL，异构藤间的检测限为0.5 μg/mL；然后信噪比S/N的比值为10∶1，结果显示钩藤碱的定量限为1.0 μg/mL，异钩藤碱的定量限为1.5 μg/mL。

1.3.6专属性试验通过精密吸取10 μL的对照品溶液以及样品溶液，在1.3.1所描述的色谱条件下对其进行测定。结果显示的钩藤碱的保留时间约在15.6 min，异钩藤碱的保留时间大约18.92 min，双峰的分离度较好，所得到结果不受钩藤药材中其他成分的影响。

1.3.7精密度试验通过精密吸取钩藤碱和异钩藤碱精密后将其混合在对照品溶液中，溶液剂量为10 μL，连续进行6次的测定，结果所得钩藤碱的峰面积RSD为1.20%，异钩藤碱的为3.13%，证明了仪器的精密度良好。

1.3.8重复性试验选取5份同一批次的钩藤样品，按照2.3所描述的方法下对供试品溶液进行制备，通过10 μL进样的方法进行检测，所得的钩藤碱含量的RSD为2.23%，异钩藤碱的为2.14%。

1.3.9稳定性试验选取同一供试品溶液，在0、2、4、6、10以及14 h时进行进样检测，所得到的结果显示，钩藤碱和异构藤间的峰面积RSD分别为4.65%和3.54%，结果显示供试品在14 h内依然稳定。

1.3.10钩藤碱及异钩藤碱加样回收率试验比较分析提取同一批次的钩藤总共6份，通过精密计算分别加入含有钩藤碱以及异钩藤碱的对照品之中，溶液有高、中、低三种浓度，提取并测定，同时计算回收率。见表1。

2　结果

2.1钩藤药材通过水煎液的方式含量结果选取6份钩藤药材，每份5 g，依照1.3.3方法进行试品的制备，分别在10 min、20 min、30 min、45 min、60 min以及90 min的时候对样品进行提取。所得到的结果显示在热稳定上，钩藤碱和异钩藤碱的表现极差，通过加热很容易将其破坏，使得药理作用缺失，不同时间段水煎液中测得钩藤碱含量为0.0025%～0.0030%，异钩藤碱的含量为0.0041%～0.0053%。

2.2正交试验优选钩藤药材的甲醇提取方法由于甲醇的用量、冷侵时间、超声时间对提取率的结果影响较大，通过表2的因素水平安排表进行试验。结果显示，在甲醇量、冷侵时间、超声时间中，对提取率的影响情况由大至小依次为，超声时间>甲醇量>冷侵时间，使用20倍质量的甲醇量，24 h的冷侵时间以及60 min的超声时间最合适。

表1　钩藤碱及异钩藤碱加样回收率试验比较分析

表2　因素水平表

2.3钩藤碱中钩藤碱与异钩藤碱的含量测量提取3个批次的钩藤药材以及标准钩藤药材，按照上面的正交试验所得到的最佳条件提取制备，然后测定钩藤碱和异钩藤碱的结果。见表3。

表3　钩藤碱中钩藤碱与异钩藤碱的含量测量(%)

3　讨论

钩藤主要产于江西、湖南、广东、云南等地区，性微寒，味甘，归肝，心包经，主要功效为清热平肝、定惊熄风[7-8]。在肝风内动，惊痫抽搐，感冒夹惊，妊娠子痫，小儿啼哭，头疼晕眩上也有很大的功效[9]。在现代药理学中，具有控制血压，扩张外周血管等作用，并且该药物毒性低，用药时带来的不良反应较小，安全性高，临床上常用于治疗高血压[10-11]。有研究显示，钩藤在抗血小板聚集以及抵抗血栓形成的过程中也有着良好的疗效[12-13]。在之前临床上有很多关于钩藤的处理方式，其中有水煎液、石油醚回流、甲醇提取、乙醇回流等[14-15]。其中乙醇回流和甲醇提取能够保证钩藤碱和异钩藤碱的提取率最高，但是乙醇回流的方式由于操作方式过于复杂，分离方式太难，并且其中的杂质也较多。此次我们使用了水煎液和甲醇的方式对钩藤中的钩藤碱和异钩藤碱进行了提取。

钩藤碱和异钩藤碱的稳定性很差，在一些极性溶液或者处于高温照射的条件下很容易形成转换，从而使得钩藤碱和异钩藤碱的含量出现降低的情况。建议将钩藤碱和异钩藤碱的标准品放在放置于冷冻、干燥且避光的环境下进行保存，不易使其中各物质含量发生降解，并且在实验时需即配即用，测定样品的时候需尽快，以得到最可靠有效的实验结果。研究显示，相比于水煎液的提取方式，通过甲醇提取钩藤中钩藤碱及异钩藤碱的方式要更为优异，这种方式所得的提取率大约在水煎液法的10倍以上，有效性高。并且此次研究对影响提取率的因素上也进行了分析，发现最佳的提取工艺和检测方式为用20倍量的甲醇量，24 h的冷侵时间以及60 min的超声时间。以往有研究显示，在对配置1周后的钩藤碱对照品溶液进行重新检测后，钩藤碱的表达依然稳定，但是异钩藤碱多出了一峰，含量变小，该作者推断是少数的钩藤碱转化成了异钩藤碱[16]。但在我们的研究中显示，钩藤碱及异钩藤碱在甲醇中24 h内的含量都呈现稳定，证明了使用钩藤碱和异钩藤碱用来对药材的质量进行评价是可靠的。

综上所述，使用甲醇进行提取在用于钩藤中钩藤碱及异钩藤碱中作用优异，对其质量的控制性好，重复性高，操作方法简单，可提高预后，值得在临床上应用推广。

[1]韦芳芳,曾常青,赵宇红,等.钩藤神经保护机制的研究进展[J].中国中药杂志,2014,39(14):2603-2607.

[2]李姗,李江,游绍雪.高效液相色谱法同时测定钩藤中4种生物碱的含量[J].贵州农业科学,2013,41(2):50-53.

[3]黄月芳,楼招欢,余芳.天麻钩藤颗粒对硝酸甘油致偏头痛模型大鼠的影响[J].中华中医药杂志,2012,27(1):230-233.

[4]雷冰坚,马健雄.钩藤生物碱类化学成分研究进展[J].华西医学,2014,29(3):592-594.

[5]Li Y，Yang W，Zhu Q，et al.Protective effects on vascular endothelial cell in N′-nitro-L-arginine(L-NNA)-induced hypertensive rats from the combination of effective components of Uncaria rhynchophylla and Semen Raphani[J].Biosci Trends,2015,9(4):237-244.

[6]焦扬,王模强,华丹,等.中药钩藤化学成分研究[J].天津医科大学学报,2013,19(2):107-109.

[7]郭晓阳.天麻钩藤汤治疗老年高血压阴虚阳亢证疗效观察[J].亚太传统医药,2014,10(22):98-99.

[8]Zhang Q，Lin C，Duan W,et al.Preparative separation of six rhynchophylla alkaloids from Uncaria macrophylla wall by pH-zone refining counter-current chromatography[J].Molecules,2013,18(12):15490-15500.

[9]董秀丽,李厚建.天麻钩藤饮合柴胡疏肝散加减治愈头晕头痛1例[J].中国民间疗法,2013,21(10):41.

[10]周倩仪,马楷奇,郭意欣,等.天麻钩藤饮联用血管紧张素转化酶抑制剂治疗原发性高血压的Meta分析[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(4):206-212.

[11]栗源,可燕,蒋嘉烨,等.天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠血管功能及肾脏蛋白表达的影响[J].中国中西医结合杂志,2015,35(4):481-487.

[12]Hao B，Yang XJ，Feng Y,et al.Pharmaceutical research progress of rhynchophylla based on chemical stability[J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,2014,39(23):4532-4537.

[13]田丽娜,高华武,龙子江,等.钩藤碱对自发性高血压大鼠的降压作用及其对血管的调节机制探讨[J].中草药,2014,45(15):2210-2213.

[14]杨秀娟,洪燕龙,吴飞,等.HPLC测定钩藤中钩藤碱和异钩藤碱的方法学探讨[J].中国中药杂志,2013,38(5):720-724.

[15]Pan H，Yang W，Zhang Y,et al.An integrated strategy for the systematic characterization and discovery of new indole alkaloids from Uncaria rhynchophylla by UHPLC/DAD/LTQ-Orbitrap-MS[J].Anal Bioanal Chem,2015,407(20):6057-6070.

[16]原田正敏,姜顺善.日本常用生药的定量方法——防己、钩藤[J].国外医药(植物药分册),1991,6(5):217-222.

(2016-03-08收稿责任编辑：张文婷)

Application in Prognosis of the Extraction and Content Determination of Rhynchophylline and Isorhynchophylline in Gambir Plant Nod

Zhang Heng, Rao Kunlin

(JingzhouCentralHospital,Hubei,Jingzhou434020,China)

Objective: To explore the application of extraction and content determination in the prognosis of uncaria rhynchophylline and isorhynchophylline in Gambir Plant Nod. Methods: The uncaria rhynchophylline and isorhynchophylline extract was taken by water extract and methanol extract methods, and the content of the extract was determined by high performance liquid chromatography. Results: The good linear relationship of rhynchophylline was in the range of 2.5～80 μg/mL, the regression equation for the time Y=76.717 0X-0.072 7(r=0.999 8),RSD<8.7%; In the linear relationship between the range of 2.0～80 μg/mL, rhynchophylline was good, the regression equation for the time Y=87.472 9X-0.366 6(r=0.999 7),RSD<7.3%. The content of rhynchophylline and isorhynchophylline extracted by methanol extraction liquid was higher than those extracted by the water. And the best way to extract the contents was under the condition of 20 times the maximum amount of methanol, 24 hours of the invasion of cold time and 60 min of sonication. Conclusion: The methanol extraction method is prominent in extracting in uncaria rhynchophylline and isorhynchophylline, with good quality control, high repeatability, simple operation, and effect of improving prognosis, which is worthy of clinical application and promotion.

Rhynchophylline; Isorhynchophylline; Extraction method

武汉市科技计划基金资助项目(编号：2013060501010152)

张恒(1982.11—)，男，本科，主管药师，研究方向：药学，E-mail：2064611@qq.com

饶坤林(1983.09—)，女，硕士研究生，主管护师，研究方向：手术室护理，E-mail：121004261@qq.com

R284.2

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.047