不同分子生物学方法检测手足口病标本的应用研究

粘志光河南省郑州大学附属洛阳中心医院检验科，河南洛阳471000

不同分子生物学方法检测手足口病标本的应用研究

粘志光
河南省郑州大学附属洛阳中心医院检验科，河南洛阳471000

目的探究不同分子生物学方法检测手足口病标本的应用。方法选取该院2014年2月—2015年9月采集的209例手足口病标本作为对象进行研究，分别予以巢式PCR、RT-PCR检测，比较两种检测方法检测结果。结果巢式PCR检测CA16阳性率、EV71阳性率及CA16+EV71双阳性率均显著高于RT-PCR检测，差异有统计学意义（P＜0.05）；对比Agilent2100与普通凝胶电泳结果，差异无统计学意义（P＞0.05）；巢式PCR检测对粪便标本、咽拭子标本的检测灵敏度均显著高于RT-PCR检测，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论应用巢式PCR检测手足口病标本，其检测灵敏度较高。

分子生物学；检测；手足口病；标本

［Abstract］Objective To study the application of differentmolecular biology methods in detecting hand-foot-mouth dis‐ease.M ethods 209 cases of hand-foot-mouth specimens collected in our hospital from February 2014 to September 2015 were selected as the research objects,and respectively detected by nested PCR and RT-PCR detection,and the detection results of the two methods were compared.Results The positive rates of nested PCR in diagnosis of CA16,EV71 and CA16+EV71 were obviously higher than those of RT-PCR detection,and the differences had statistical significance,P《 0.05,and the difference between the Agilent 2100 result and common gel electrophoresis result had no statistical signifi‐cance,P>0.05,and the detection sensitivity degree of nested PCR for stool specimens and pharynx specimenswas obviously higher than that of RT-PCR detection and the difference had statistical significance,P《0.05.Conclusion The application of nested PCR in detecting hand-foot-mouth disease specimens has a higher detection sensitivity degree.

［Key words］Molecular biology;Detection;Hand-foot-mouth disease;Specimen

手足口病为婴幼儿常见急性感染病，主要由肠道病毒感染导致，其临床主要症状为足底、手部及口腔黏膜疹或溃烂后进展为溃疡，多伴有全身乏力、食欲不振、发热及精神萎靡等[1]。疱疹主要在足心、手部、颊粘膜、牙龈、舌部出现，部分也可在臀部出现。传统病原学诊断方法检测灵敏度较低，价格昂贵，且检测时间较长，无法为临床早期诊治手足口病提供病原学支持[2]。因此，如何建立特异、快速、简便、价格适中的病原学检测方法，从而为手足口病的早期治疗提供有力支持已经成为目前临床学者研究的重要课题[3]。该研究分析不同生物学方法检测在手足口病中的应用，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取该院2014年2月—2015年9月采集的209例手足口病标本作为对象进行研究。所有患者均符合手足口病诊断标准①发热；②口腔黏膜疹，可进展为口腔溃疡；③皮疹，多发于足底、手掌，部分为水泡；④伴有相关中枢神经系统症状。

1.2检测方法

1.2.1标本采集无菌操作，患者发病后5d左右采集粪便2 g，置入灭菌消毒后的专用盒内保存。以干棉签正确擦拭患者鼻咽部位，采集完毕后立即置入专用试管保存。以上标本均置于-80°冰箱内保存。

1.2.2标本检测依据病毒核酸提取试剂说明书严格操作，收集病毒。依据EV端基因序列选取合适引物，应用软件辅助排列肠道病毒VP1-3之间进行CA16、EV71引物序列，引物不同相对应产物也不同。所有手足口病标本分别予以RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）及卵巢式PCR检测。卵巢PCR反应条件：45℃时45min逆转录，94℃时20 s变性，94℃时2min预变性，45℃时25 s退火，72℃时30 s延伸，共计36循环。RT-PCR反应条件如上。实验病毒设阳性、阴性对照，实验进行3次。RT-PCR结果采用深圳赛泽尔电子有限公司提供的荧光自动检测仪分析；卵巢式PCR结果应用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.3PCR产物检测应用琼脂糖凝胶电泳1.2%检测209例PCR产物，应用Agilent 2100分析验证其中10 例PCR产物。

1.4统计方法

通过SPSS20.0对数据进行分析，用n（%）表示计数资料，组间分布采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1比较巢式PCR、RT-PCR检测结果

巢式PCR检测CA16阳性率为28.23%（59/209），EV71阳性率为71.77%（150/209），CA16+EV71双阳性率20.10%（42/209）；RT-PCR检测CA16阳性率为21.53%（45/209），EV71阳性率为35.41%（74/209），CA16+EV71双阳性率7.18%（15/209）。巢式PCR检测CA16阳性率、EV71阳性率及CA16+EV71双阳性率均显著高于RT-PCR检测，差异有统计学意义（P＜0.05）；见表1。

表1　比较巢式PCR、RT-PCR检测结果（n）

2.2比较Agilent 2100与普通凝胶电泳结果

对比Agilent2100与普通凝胶电泳结果，差异无统计学意义（P＞0.05）；见表2。

表2　比较Agilent2100与普通凝胶电泳结果（n）

2.3比较巢式PCR、RT-PCR检测对粪便标本的检测结果

巢式PCR检测粪便标本CA16阳性率为35.15% （58/165），EV71阳性率为32.73%（54/165），CA16+EV71双阳性率27.27%（45/165）；RT-PCR检测粪便标本CA16阳性率为18.18%（30/165），EV71阳性率为12.73%（21/165），CA16+EV71双阳性率7.18%（15/ 209）。巢式PCR检测对粪便标本的检测阳性率显著高于RT-PCR检测，差异有统计学意义（P＜0.05）；见表3。

表3　比较巢式PCR、RT-PCR检测对粪便标本的检测结果（n）

2.4比较巢式PCR、RT-PCR检测对咽拭子标本的检测结果

巢式PCR检测咽拭子标本CA16阳性率为9.09% （4/44），EV71阳性率为65.91%（29/44），CA16+EV71双阳性率2.27%（1/44）；RT-PCR检测咽拭子标本CA16阳性率为6.82%（3/44），EV71阳性率为25.00%（11/ 44），CA16+EV71双阳性率0。巢式PCR检测对咽拭子标本的检测阳性率显著高于RT-PCR检测，差异有统计学意义（P＜0.05）；见表4。

表4比较巢式PCR、RT-PCR检测对咽拭子标本的检测结果（n）

3　讨论

手足口病由肠道病毒感染导致，多发于婴幼儿群体中。多数患者临床症状较轻微，呈现自限性，部分患者可导致全身性炎症反应综合征发生[4]。20多种以上肠道病毒均可引发手足口病，其中CA16（柯萨奇病毒A16）、EV71（肠道病毒71）为两个主要致病病原体[5]。EV71感染为主的手足口病在世界各地流行出现在上世纪90年代后，其中亚太地区为该病高发区[6]。相关研究指出[7]，柯萨奇病毒A16、埃可病毒、肠道病毒71与人类疾病联系紧密，在全世界范围内广泛流行，常见于婴幼儿群体中。病原体检测、CA16、EV71的感染情况、流行病学特征对预防、控制手足口病及病原体疫苗的研发具有重要意义。近年来，RT-PCR对手足口病标本的检测灵敏度存在争议。该研究应用巢式PCR与RT-PCR分别检测手足口病标本，对比其检测结果，差异显著。

RT-PCR为将RNA逆转录及cDNA聚合酶链式扩增结合的方式，在逆转录缓冲液中，通过逆转录酶将RNA合成cDNA，将合成的cDNA作为模板，从而扩增合成所需片段。其检测技术灵敏、应用广泛，多用于细胞基因表达水平检测中[8]。巢式PCR为变异聚合酶链反应，应用两对PCR引物扩增片段，其优势在于，若第一次扩增错误片段，第二次不易在错误片段上配对引物扩增片段，且扩增具有特异性[9]。本研究结果显示，209例手足口病患者中，巢式PCR检测CA16阳性率为28.23%，EV71阳性率为71.77%，；RT-PCR检测CA16阳性率为21.53%，EV71阳性率为35.41%。结果充分表明巢式PCR检测敏感性较高。应用巢式PCR、RT-PCR分别检测粪便标本及咽拭子标本，分析得知，RT-PCR检测阳性率高于巢式PCR检测，同时统计分析两种检测方法检测敏感性，结果显示巢式PCR检测敏感性较高。该研究对比Agilent 2100 Bioanalyzer与普通凝胶电泳分析PCR产物结果，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果充分说明Agilent2100 Bioanalyzer与普通凝胶电泳均可应用于pcr产物检测分析。相关文献指出[10]，Agilent 2100 Bioanalyzer广泛应用于食品安全及蛋白质领域，且近年来逐渐应用于实验室检测中，其分析PCR产物时，可有效抑制致癌物对人体造成污染，在疾病控制工作中具有重要意义。

综上所述，应用巢式PCR检测手足口病标本，其检测灵敏度较高，在临床研究中具有推广与应用价值。

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App lication Research on Different M olecular Biology M ethods in Detecting Hand-foot-mouth Disease

NIAN Zhi-guang
Department of Clinical Laboratory,Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University,Luoyang,Henan Province, 471000 China

R7

A

1672-5654（2016）06（a）-0105-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.16.105

粘志光（1982.10-），男，河南洛阳人，本科，卫生主管技师，主要从事自身免疫性疾病、出凝血疾病、分子生物学的实验室检测诊断。

2016-03-09）