产γ-氨基丁酸屎肠球菌的筛选及γ-氨基丁酸的定量

朱　泉　程金龙　朱元召　尹　龙　倪晋东　程茂基　杨章平

(1.安徽农业大学动物科技学院，合肥230061；2.江苏优仕生物科技发展有限公司，宿迁223831；3.安徽科技学院动物科学学院，凤阳233100；4.扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009)



产γ-氨基丁酸屎肠球菌的筛选及γ-氨基丁酸的定量

朱泉1程金龙2朱元召3*尹龙2倪晋东2程茂基1杨章平4

(1.安徽农业大学动物科技学院，合肥230061；2.江苏优仕生物科技发展有限公司，宿迁223831；3.安徽科技学院动物科学学院，凤阳233100；4.扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009)

本试验旨在利用分子生物学方法鉴定分离得到1株产γ-氨基丁酸(GABA)屎肠球菌，并定量测定所产GABA的量。从泡菜、酸奶、土壤、新鲜牛奶样品中筛选出一目标菌株F6，进行形态学特征与革兰氏染色鉴定；再扩增菌株F6的16S rDNA基因，然后测定该基因序列和构建系统发育树；同时采用高效液相色谱(HPLC)法定量测定菌株F6发酵液中的GABA含量。结果表明：菌株F6菌落大而光滑、圆形、直径1～2 mm、边缘整齐、乳白色；在分离培养基上菌落周围形成透明圈，使分离培养基呈黄色；在MRS固体培养基上菌落不透明，周围有透明圈。革兰氏染色鉴定菌株F6为阳性菌。分子生物学鉴定分析显示，菌株F6的16S rDNA基因序列与GenBank数据库中屎肠球菌(Enterococcusfaecium)的相似性大于99%。HPLC法测定得到GABA标准曲线线性方程为Y=7 080 733.139 5X-4 511.692 7(R2=0.999 4)，通过方程得出菌株F6发酵液中的GABA含量为7.1 g/L，保留时间为7～10 min。结果提示，本试验筛选得到1株高产GABA的屎肠球菌F6。

屎肠球菌；γ-氨基丁酸；16S rDNA基因序列；高效液相色谱法定量；筛选

乳酸菌具有调节机体胃肠道微生态平衡、有益于畜禽健康、改善畜禽生产性能、减少环境污染、替代饲用抗生素等重要作用，在动物生产中的应用日益广泛。然而，乳酸杆菌为厌氧菌，抗逆性差、不耐氧、易失活，应用效果不稳定，而球菌较杆菌具有更强的抗逆性，菌株活性损失较低，未来球菌尤其是肠球菌的应用将更普遍。

γ-氨基丁酸(GABA)又称氨酪酸[1]，分子式为C4H9NO2，是哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质，介导40%以上的抑制性神经传导[2-3]。GABA对人具有调节血压、改善脑部机能、增强记忆力、抗焦虑、镇痛等生理活性，对畜禽具有促进采食、抗应激、镇静、改善生产性能等功效[4]，尤其是抗热应激作用显著。GABA合成制备的方法主要有化学合成、微生物发酵等，目前畜禽生产上应用的GABA多为化学合成提纯品，成本昂贵，颇少见应用微生物发酵产生的GABA[5]。

长期以来，学者致力于研究乳酸菌等单一功能的微生态制剂与化学合成提纯的GABA，已清楚乳酸菌和GABA均是重要的功能性添加剂[6]。但有关能分泌GABA的乳酸菌的研究较少。屎肠球菌(Enterococcusfaecium)属肠球菌属，又称屎链球菌，可分成许多群，屎肠球菌属于D群，D群链球菌中的肠球菌包括粪肠球菌、屎肠球菌和坚忍肠球菌。自然界存在的肠球菌所能分泌的GABA量很少或不能分泌，需要摸索适宜生长条件以提高其GABA产量，目前对产GABA屎肠球菌的研究颇少。为此，本试验开展高产GABA屎肠球菌的筛选与鉴定，既能应用绿色微生态和微生物发酵所产天然GABA，降低GABA添加成本，又能叠加发挥GABA抗应激与乳酸菌微生态平衡调控的双重功效，旨在为开发功能性微生态制剂及其在养殖中的应用提供理论基础。

1　材料与方法

1.1菌株及培养基

菌株来自泡菜(购自农贸市场)、酸奶(蚌埠市双华乳品有限公司产品)、土壤(取自安徽科技学院西校区)、新鲜牛奶(购自安徽科技学校畜牧科技园)。

MRS固体培养基制备[7]：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖20 g、三水合醋酸钠5 g、柠檬酸二胺2 g、吐温80.1 g、磷酸氢二钾2 g、七水硫酸镁0.58 g、四水硫酸锰0.25 g、碳酸钙7.5 g、琼脂22.5 g，用去离子水定容至1 000 mL，pH 6.5，121 ℃灭菌40 min。

MRS液体培养基：除不含碳酸钙、琼脂外，其他成分与MRS固体培养基相同，再用蒸馏水定容至1 000 mL，pH 6.5。

分离培养基：牛肉膏10 g、酵母膏10 g、蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、吐温80.5 g、番茄汁200 g、溴甲酚绿0.1 g、碳酸钙20 g、琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 6.5。

1.2目的菌株的分离、纯培养与活化传代

取泡菜、酸奶、土壤、新鲜牛奶样品各1 g，分别接种于装有MRS液体培养基的150 mL三角烧瓶中，35 ℃静止培养48 h；无菌操作将培养液接种于分离培养基中，35 ℃条件下静止培养48 h；无菌操作挑取分离培养基中周围呈现黄色的疑似单个菌落，接种于MRS液体培养基中，37 ℃静止培养48 h。

取1 mL MRS液体培养液与无菌生理盐水10倍梯度稀释成10-6、10-7、10-83个浓度梯度，取100 μL 10-8浓度梯度溶液均匀涂布MRS固体培养基平板，37 ℃培养48 h。无菌操作挑取出现圆形乳白色并有溶钙圈的单个菌落，进行分离纯化。

将所筛菌株接种于MRS斜面培养基上，35 ℃培养48 h，4 ℃保存，菌株每20 d传代1次。将保藏菌株接种于MRS固体培养基中，35 ℃培养48 h，再转接至MRS液体培养基中培养22 h用作发酵种子菌株。

1.3目的菌株的革兰氏染色鉴定

对目的菌株进行革兰氏染色，观察菌株的形态特征。

1.4目的菌株的分子生物学鉴定

取10 mL菌株培养液，低速离心获得菌体。用细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302，上海生工生物工程有限公司)提取细菌总DNA。以10 ng纯化的细菌总DNA作为模板，扩增16S rDNA基因。所用引物为原核生物16S rDNA基因的通用引物：上游引物为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物为5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增体系为50 μL，包括：1.0 μL DNA模板，5.0 μL 10×Buffer，2.0 μL dNTP，1.0 μL上游引物(10 pmol/μL)，1.0 μL下游引物(10 pmol/μL)，1.0 μL Taq DNA聚合酶，1.4 μL Mg2+，补重蒸水(ddH2O)至50 μL。扩增条件：94 ℃，5 min；94 ℃，1 min，56 ℃，1 min，72 ℃，2 min，30个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃终止反应。PCR产物全序列由上海生工生物工程有限公司测定。

1.5序列分析及系统发育树的构建

根据16S rDNA基因测序结果，使用核算序列对比检索(nucleotide basic local alignment search tool，N-BLAST)比对初步确定菌种。结合GenBank中乳酸菌属(Lactobacillus)中其他菌种的16S rDNA基因序列，利用MEGA 3.0软件绘制系统发育树。

1.6目的菌株所产GABA的定性测定

将上述所得种子液以3.5%接种量无菌操作接种于发酵培养基中，37 ℃恒温培养48 h，取发酵液5 mL，4 500 r/min离心5 min，取上清采用改良纸层析法检测发酵液中是否含有GABA。改良纸层析的测定方法是：按0.55%的比例将显色剂茚三酮加入展开剂中，展开剂组成为正丁醇∶冰醋酸∶水=5∶3∶1(体积比)，取待测液10 μL进行点样，GABA配成浓度5 g/L做参比，展开后85 ℃显色8 min。若纸层析反应体系中存在与GABA标准品相对迁移率一致的茚三酮显色斑点，说明样品中含有GABA，则该菌即为筛选到的产GABA的菌株，将筛选得到的产GABA目的菌株进行保藏。

1.7目的菌株所产GABA的定量测定

高效液相色谱(HPLC)法定量测定菌液中GABA含量的原理：在菌液中加β-巯基乙醇，使GABA与邻苯二甲醛迅速反应，生成邻苯二甲醛(OPA)衍生物；在紫外区338 nm处，根据OPA衍生物的吸收峰，通过测定其吸光度值精确测定样品中的GABA含量。

GABA标准溶液的配制：用电子天平准确称量GABA标准品，配制浓度分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的标准GABA溶液。

HPLC检测条件如下：仪器型号为Waters-1525；色谱柱为Hypersil ODS-2 C18(150 mm×4.0 mm，5 μm及相应的保护柱)；检测器为紫外检测器；进样量为20 μL；流动相A为20 mmol/L醋酸钠缓冲液(醋酸钠2.72 g、三乙胺200 μL，加超纯水至1 L，调节pH为7.3)，0.22 μm滤膜过滤，脱气；流动相B为乙腈，流动相A∶流动相B=4∶1；流速为1 mL/min；柱温为40 ℃；衍生试剂为OPA 20 mg，加β-巯基乙醇20 μL、乙腈5 mL混匀即可。衍生反应：取硼酸缓冲液100 μL(硼酸24.7 g，加超纯水1 L，调节pH至10.4)，OPA衍生剂20 μL，样品20 μL，混合均匀后室温反应5 min后开始测定。

2　结果与分析

2.1目的菌株的菌落特征

从泡菜、酸奶、土壤、新鲜牛奶中分离得到多个菌株，选取其中的1个菌株F6进行形态学观察鉴定。菌株F6菌落光滑、圆形、直径1～2 mm、边缘整齐、乳白色，表面细腻(图1)。在分离培养基上培养生长的F6菌落使其周边的培养基变成黄色，菌落周围形成透明圈(图1-A)，这是由于乳酸菌生长过程中产生乳酸，能使含有溴甲酚绿的分离培养基变成黄色，推测F6是一株乳酸菌。在MRS固体培养基上培养生长的F6菌落不透明，周围有透明圈(图1-B)。

图1　菌株F6的菌落形态

2.2目的菌株所产GABA的定性测定

改良纸层析法分析结果显示，目的株菌F6具有与GABA标准品相同Rf值(即指比移值，斑点中心距原点的距离与溶剂展开前沿距原点距离的比值)的斑点，层析斑点较深，表明GABA产量较高，图2为目的株菌的改良纸层析图谱。

2.3目的菌株的形态特征

菌株F6的染色结果如图3所示，菌体形态呈圆或椭圆形，直径0.5～1.0 μm，大多数呈双或短链状排列，通常不运动，革兰氏染色呈阳性。

图2　菌株F6的发酵液改良纸层析图谱

图3　菌株F6的显微结构图

2.416S rDNA基因序列分析与系统发育树构建

菌株F6的16S rDNA基因测序后，提交到DNA序列数据库GenBank。将测得的菌株F6的16S rDNA序列在美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)主页上进行N-BLAST分析比对，结果如图4所示。菌株F6的16S rDNA基因序列与GenBank数据库中屎肠球菌的相似性大于99%，表明两者均为屎肠球菌的不同菌株。

图4　菌株F6的16S rDNA基因序列

菌株F6的16S rDNA基因序列与NCBI主页GenBank数据库中部分细菌的16S rDNA基因序列进行同源性比对，为显示菌株F6与相似菌种之间的亲缘关系及其系统地位，用MEGA 3.0软件构建系统发育树(图5)。结果显示，菌株F6与屎肠球菌的亲缘关系最近，其次是坚忍肠球菌。由此确定菌株F6为屎肠球菌。

2.5目的菌株所产GABA的定量测定

2.5.1标准曲线绘制

采用HPLC法精确测定标准液中GABA含量[8-9]，GABA标准液中的GABA峰形如图6所示。以峰面积对GABA含量作图，准确绘制出标准曲线(图7)。结果显示，峰面积和GABA含量呈强相关的线性关系，线性方程为：Y=7 080 733.139 5X-4 511.692 7(R2=0.999 4)。

Bacillussp.：芽孢杆菌；Enterococcusfaecium：屎肠球菌；Bacterium：细菌；Enterococcusdurans：坚忍肠球菌；Leuconostocmesenteroides: 肠系膜明串珠菌；strain：品种。

图5以菌株F6的16S rDNA基因序列为基础的系统发育树

Fig.5Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of bacterial strain F6

图6　标准液中GABA的HPLC检测图

图7　HPLC法建立的GABA的标准曲线

2.5.2目的菌株所产GABA的定量

采用HPLC法精确测定菌株F6发酵液的色谱图峰面积，如图8所示。根据上述得到的线性方程Y=7 080 733.139 5X-4 511.692 7，计算出菌株F6发酵液中GABA含量为7.1 g/L，保留时间为7～10 min，峰面积为50 268 693.6，吸光度值为0.12。

3　讨　论

3.1产GABA屎肠球菌的筛选

从酸奶、土壤、牛奶、泡菜中均分离得到产GABA的菌株，其中自酸奶样品中筛选得到的一菌株产GABA量相对较高，命名F6，表明从自然界中筛选高产GABA目的菌株是可行的。本试验在对目的菌株传统表型特征、生物学特性等进行快速筛选的基础上，采用改良纸层析法对目的菌株代谢产物GABA进行定性检测，准确、快速确定了菌株产GABA的能力。改良后纸层析法为按0.55%的比例将显色剂茚三酮加入展开剂中，展开剂组成为正丁醇∶冰醋酸∶水=5∶3∶1(体积比)，展开后85 ℃显色8 min，相比一般纸层析法显色时间15～20 min有明显优势[10]，对快速筛选高产GABA目的菌株有一定参考价值。本试验通过分子生物学方法，将菌株F6的16S rDNA基因序列与GenBank数据库中部分细菌的16S rDNA基因序列进行同源性比对，其与屎肠球菌的相似性大于99%，确定目的菌株F6为屎肠球菌，这为通过基因工程菌大量制备GABA提供了目的菌株。

图8　菌株F6发酵液中GABA的HPLC检测图

3.2GABA的制备方法

GABA的制备方法有化学合成法和生物合成法2种[10]。化学合成法成本较高，得率较低，并且在生产工艺中使用危险溶剂，甚至是有毒溶剂，因此化学合成法制备的GABA不能用于食品和饲料，也不能认为是一种天然的食品或饲料添加剂[11-12]。生物合成GABA是应用纯的微生物技术，通过筛选优良高产的安全菌种发酵生产得到，是天然食品与饲料添加剂，公认使用的安全菌为乳酸菌，如短小乳杆菌[10]，而筛选的产GABA屎肠球菌颇少。生物合成法获得的GABA虽然纯度不高，但动物的吸收率比高纯度化学合成法的GABA有较大提高，并且产GABA乳酸菌可不经提纯,直接添加到动物饲粮中。本试验以屎肠球菌为目标菌株，较乳酸杆菌的抗逆性更强，因此可发挥乳酸菌的微生态平衡调控和GABA抗应激的双重作用，功效叠加。

3.3乳酸菌的GABA产量

自然界中直接筛选的乳酸菌合成GABA产量一般都不高，为5～7 g/L[13-14]，所用菌株多为乳酸杆菌类。冯志彬等[15]研究短小乳杆菌A8菌株后发现，初始pH 4.5、温度33 ℃、接种量20%、发酵时间3 d为该菌株的最佳发酵条件，GABA产量最高可达19.2 g/L，并发现培养基的pH是影响GABA产量的主要因素。本试验目的菌株为屎肠球菌，发酵液中GABA含量为7.1 g/L；最佳发酵条件为发酵温度36 ℃、原始pH 6.4、接种量4.5%、种龄20～23 h、发酵时间60 h，在最佳培养、发酵条件下，屎肠球菌F6发酵液中GABA的含量可提高到9.5 g/L，这可能与不同培养条件影响目的菌株谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)的活性有关。

利用传统诱变技术筛选能够提高乳酸菌的GABA产量。夏江等[16]先后使用紫外线和γ-射线对产GABA的短乳杆菌进行诱变处理，使GABA平均产量提高142.9%，经诱变处理的短乳杆菌虽然GABA产量提高，但乳酸菌的固有功能作用降低，并且因不确定性、盲目性和遗传不稳定性，利用诱变乳酸菌所产GABA尚有潜在安全风险。

近几年，有文献报道利用重组大肠杆菌表达提取GAD，以固定化酶的方式生产GABA，但是转化效率普遍不高[17]。已清楚GABA的生物合成途径是谷氨酸脱羧酶将L-谷氨酸转化为GABA。本后续试验拟通过增加现有菌株F6中GAD基因表达盒的数量，提高菌株细胞内GAD的表达，进而提高GABA的合成量[18-20]，这尚在研究中。

3.4屎肠球菌所产GABA的定量测定

本试验首先对发酵液中GABA进行定性测定，即采用改良纸层析法检测发酵液中是否含有GABA。按0.55%的比例将显色剂茚三酮加入到展开剂中，展开后85 ℃显色8 min，通过观察斑点快速定性确定GABA的存在。

本试验采用HPLC法测定发酵液中GABA的含量，GABA在β-巯基乙醇存在条件下能与邻苯二甲醛迅速反应，生成OPA衍生物，而OPA不会干扰检测，色谱图基线较稳定，标准曲线的R2为0.999 4，因此本试验采用的HPLC法简单、快速、灵敏，得到的结果可靠。

4　结　论

本试验筛选得到的菌株F6为屎肠球菌，是一株功能性乳酸菌，具有高产GABA的能力。

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(责任编辑菅景颖)

, professor, E-mail: zhuyuanzhao111@163.com.cn

Screening ofEnterococcusfaeciumProducing γ-Amminobutyric Acid and Quantitative Detection of γ-Amminobutyric Acid

ZHU Quan1CHENG Jinlong2ZHU Yuanzhao3*YIN Long2NI Jindong2CHENG Maoji1YANG Zhangping4

(1. College of Animal Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230061, China; 2. Jiangsu Unison Biotechnology Development Co., Ltd., Suqian 223831, China; 3. College of Animal Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China ; 4. College of Animal Science and Technology,Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

This study was aimed to isolate and identify anEnterococcusfaeciumby molecular biological methods which produced γ-aminobutyric acid (GABA), moreover, the amount of GABA was also quantitatively determined. One target strain ofEnterococcusfaeciumF6 was screened out from the samples of pickles, yogurt, soil and fresh milk, and was identified according the morphological characters and Gram stain methods. After the 16S rDNA gene of bacterial strain F6 was amplified, the gene sequence and phylogenetic tree were analyzed. Meanwhile, the GABA content in the fermented solution of bacterial strain F6 was quantitatively determined by high performance liquid chromatography (HPLC) method. The results showed that the bacterial strain F6 took a large, smooth, round and a neat edge of shape with a diameter of 1 to 2 mm and in a milky white color. A transparent circle was formed around the colony on the separating medium which changed to be yellow. On the MRS solid medium, the colony was opaque with a transparent circle around. Gram stain was used to identify F6 as a positive strain. The 16S rDNA gene sequence of bacterial strain F6 was more than 99% similarity to that ofEnterococcusfaeciumin GenBank showed by molecular biological analysis. HPLC method was used to draw out the GABA standard curve linear equation as follows:Y=7 080 733.139 5X-4 511.692 7 (R2=0.999 4), and the content of 7.1 g/L of GABA with 7 to 10 minutes of retention time was determined in the fermented solution of F6 according to linear equation. The results indicate that a high yield GABA ofEnterococcusfaeciumF6 is finally obtained.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(8)：2504-2511]

Enterococcusfaecium; γ-aminobutyric acid; 16S rDNA sequence; quantitative detection by high performance liquid chromatography method; screening

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.08.022

2016-02-24

安徽高校自然科学研究项目计划(KJ2015A247)；宿迁市农业科技支撑项目(L201405)；宿迁市产业发展引导资金项目(M201512)

朱泉(1994—)，男，安徽全椒人，硕士研究生，从事动物营养与饲料科学研究。E-mail: zhudtq@163.com

朱元召，教授，硕士生导师，E-mail: zhuyuanzhao111@163.com

S816.7

A

1006-267X(2016)08-2504-08