不同生长环境对黄芪叶绿体超微结构的影响1)

张艳贺　任伟超　闫嵩　刘振鹏　张开雪　马伟

(黑龙江中医药大学，哈尔滨，150040)



不同生长环境对黄芪叶绿体超微结构的影响1)

张艳贺任伟超闫嵩刘振鹏张开雪马伟

(黑龙江中医药大学，哈尔滨，150040)

选用蒙古黄芪(Astragalusmembranaeus(Fisch) Bge. Var. Mongh-oicus (Bge) Hisao)和膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch) Bge.)种子在不同的环境中进行种植，观察内生真菌、盐碱胁迫以及遮光处理对黄芪叶绿体超微结构的影响。结果表明:内生真菌处理组叶绿体和类囊体形态结构完整；盐碱胁迫处理组，蒙古黄芪叶绿体类囊体受损，基粒片层溶解，淀粉粒数量增多、直径增大。遮光处理组膜荚黄芪类囊体、基粒片层溶解，淀粉粒大量出现。蒙古黄芪栽培在透光率较低处，膜荚黄芪生长于盐碱处对其生长影响较小。黄芪栽培过程中，适当加以内生真菌菌液，有利于黄芪的生长。

黄芪；超微结构；遮光率；盐碱胁迫；内生真菌

WithAstragalusmembranaeus(Fisch) Bge. Var.mongholicus(Bge)Hisao andAstragalusmembranaceus(Fisch) Bge. seeds in different planting, we studied the effects of endophytic fungi, salt stress and cover light treatment onAstragaluschloroplast ultrastructure. The results showed that endophytic fungi group, chloroplast and thylakoid morphology robust. In the salt stress treatment group,A.membranaeuschloroplast thylakoid was damaged, grana lamellae was dissolved, the number of starch grains was increased, and the diameter was increased. In the shading treatment group,A.membranaeusthylakoid grana lamellae was dissolved, and many starch grains appeared. WhenA.membranaeuscultivation was in the lower light transmittance,A.membranaeusgrowth in salt had little effect on the growth of the department. The proper cultivation of the endophytic fungus is beneficial to the growth of Astragalus.

黄芪是豆科植物膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch) Bge.)或蒙古黄芪(AstragalusmembranaceusBge. Var.mongholicus(Bge.) Hsiao)的干燥根。始载于神农本草经被列为补养药物之上品，目前也是我国药膳同食品种。市场应用量较大，以人工种植为主。现以山西、甘肃、内蒙古以及黑龙江等四省区为主产区。不同生长环境对植物叶绿体超微结构的影响已有较多的报道[1-5]，但是不同环境对黄芪叶绿体超微结构的研究国内外尚无报道。本试验通过在不同环境下观察内生真菌、盐碱浓度、遮光率对膜荚黄芪和蒙古黄芪叶绿体超微结构的影响，以期为黄芪的栽培提供依据。

1　材料与方法

仪器：包埋板；LEICA ULTRACUTUCT切片机；TECNAIG2型透射电子显微镜，CLASSⅡTYPE B2洁净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；HZQ-F160震荡培养箱(中国哈尔滨市东联电子科技开发有限公司)；SHB-111循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

试剂：1%的磷酸缓冲液(PBS)；4%戊二醛；不同体积分数的丙酮、乙醇(70%、80%、90%、95%、100%)；1%锇酸固定液，饱和醋酸双氧铀染液，柠檬酸铅染液，Epon 812 包埋剂均为黑龙江中医药大学检测实验室提供。

试验材料的处理：材料购自河北安国药材市场的蒙古黄芪(Astragalusmembrana-eus(Fisch) Bge. Var. Monghoicus (Bge) Hisao)和膜荚黄芪(Astragalusmembran-aceus(Fisch) Bge.)种子，6月19日播种于黑龙江中医药大学药用植物园，栽培管理同大田。每组种植2行，行长2 m，行距0.23 m，采用密植种植。其中2号和6号两组考虑到试验过程中可能造成的对土壤的破坏，选用直径为35 cm的花盆种植。当幼苗出土1个月后开始对黄芪幼苗采用不同的处理方法，如表1所示。

其中，Y-1和Y-5两种处理选用孔祥军从黄芪中提取出来的黄芪内生真菌，参照孔祥军[6]的培养方法进行培养。对黄芪中分离出来的青霉菌属、镰孢菌属、赤壳菌属(2株)的4种内生真菌进行培养，选用PDF培养基在28 ℃、150 r·min-1条件下培养7 d。将培养液通过减压抽滤法去除菌球，得到菌液。将菌液喷洒在幼苗叶片及根部。

表1　分组情况及不同分组处理方法

Y-2和Y-6号则将配置好的30 mol·L-1NaHCO3、Na2CO3溶液浇在花盆中，直到水从花盆底部流出为止。Y-3和Y-7号为对照组，除正常的苗间管理不做其他处理，Y-4和Y-8号采用30%遮光处理，在地面上60 cm处加盖遮阴网。

取健康黄芪叶片中部，避开大叶脉，切成5.0 mm×1.0 mm的小块，立即投入4%戊二醛溶液中固定，并用真空抽滤泵抽取表层空气，使叶片尽快沉到固定液中，固定24 h(4 ℃)，用磷酸缓冲液冲洗3次，每次10 min(4 ℃)，再用体积分数为70%、80%、90%、95%、100%乙醇依次脱水，脱水后转移至丙酮内，最后用Epon812包埋剂浸透包埋。利用LEICA ULTRACUTUC型超薄切片机切片，醋酸双氧铀—柠檬酸铅双重染色，TECNAIG2型透射电子显微镜下观察、照相。

2　结果与分析

通过对空白试验组的观察发现黄芪种间存在一定的差异，主要体现为膜荚黄芪叶绿体以弓形为主，而蒙古黄芪则主要为标准肾形。同时基粒片层数亦存在差异，本试验样品中，Y-3号中类囊体垛数较多，而Y-7号中基粒片层数较多。正常成长条件下，也会存在一定数量的嗜锇滴和小的淀粉粒。试验结果见图1所示。

2.1内生真菌对黄芪叶绿体超微结构的影响

内生真菌多为对植株生长有益的菌群，植物可以通过共生的真菌获得土壤中的矿物质养分[7]。本试验所用黄芪内生真菌分离自蒙古黄芪根茎中。试验过程中将此菌群大量的接种到黄芪植株上，影响植株中正常的菌群数量及比例，以达到影响植株生长的作用。通过对叶片超微结构的观察发现，膜荚黄芪和蒙古黄芪在内生真菌处理前后，Y-1号样品中嗜锇滴数目较多，类囊体数目也较多，在视野范围内并未发现明显的淀粉粒出现。在Y-5号样品中，存在着为数不多的小块淀粉粒，叶绿体膜结构完整，类囊体膜清晰可见，嗜锇滴数目较少。说明在内生真菌作用下，有利于黄芪的生长。

2.2盐碱胁迫对黄芪叶绿体超微结构的影响

盐碱胁迫组叶绿体中出现大量较大的淀粉粒，此处出现的淀粉粒数目多且每颗淀粉粒体积均较大，是植物在逆境中自我保护的一种表现。并且类囊体数及基粒片层均少于空白组试验，嗜锇颗粒数目也较空白试验组少，Y-6号蒙古黄芪产生更多的淀粉粒，并且基粒片层减少更加明显。因此，从显微观察的层面上来说，盐碱胁迫会对黄芪生长有抑制作用，对Y-2号膜荚黄芪影响较小，黄芪在盐碱胁迫的逆境中，有一系列的自我保护的方式，来减少外界对细胞损伤。

2.3光强度对黄芪叶绿体超微结构的影响

在遮光组试验中，我们发现Y-4号膜荚黄芪的叶绿体几乎全部被淀粉粒所占据，叶绿体变为圆形，基粒片层数及类囊体数目减少，且大量的叶绿体内膜发生溶解，使视线内膜结构变模糊。Y-8号蒙古黄芪叶绿体形态和数目未见明显变化，类囊体数和基粒片层数均未发生大的变化。由此可知，在超微结构层面上，遮阴处理对蒙古黄芪影响较小，对膜荚黄芪影响较大。即蒙古黄芪在遮阴环境中较适于生长，而对膜荚黄芪生长产生极度不利影响。

3　结论与讨论

本试验通过不同生长环境的蒙古黄芪、膜荚黄芪叶绿体超微结构观察，发现内生真菌处理有利于黄芪叶绿体及类囊体保持形态和结构的完整性，有助于黄芪的生长；盐碱胁迫组中蒙古黄芪叶绿体、类囊体受损，基粒片层溶解，大粒径淀粉粒增多。膜荚黄芪叶绿体形态结构完整，遮光处理组膜荚黄芪出现类囊体、基粒片层溶解，淀粉粒大量出现。而蒙古黄芪叶绿体形态结构完整，表明在透光率较低的环境中对蒙古黄芪影响较小，膜荚黄芪在盐碱胁迫土壤中影响较小，同时，在黄芪生长过程中喷洒一定量的黄芪内生真菌有利于黄芪生长。

有无内生真菌处理相比，膜荚黄芪叶绿体结构变细长，类囊体数目减少，基粒片层数目增多。蒙古黄芪叶绿体变为椭圆形，基粒片层数增多，类囊体膜机构清晰。内生菌多为益生菌[8]，本试验中使用的内生菌分离自蒙古黄芪，对蒙古黄芪生长更为有利。基粒片层数目增多，提高植物光能利用率，增加光合作用效率。

植物叶绿体超微结构的稳定性与其耐盐性密切相关[9-10]。在盐碱胁迫下，耐盐植物叶绿体通常表现为结构完整、基粒片层清晰、类囊体结构完整，而不耐盐植物表现为叶绿体超微结构变形、基粒片层模糊，严重时基粒片层扭曲，叶绿体解体、失去完整结构[11]。在盐碱胁迫条件下，膜荚黄芪叶绿体中类囊体数目减少，淀粉粒直径增大。蒙古黄芪中出现叶绿体结构变成类圆形、基粒片层溶解、内膜结构模糊的现象。这是盐碱胁迫下对黄芪生长产生的不利影响，蒙古黄芪光能捕捉和光能转化的场所受到破坏，使其生长受到抑制。盐碱胁迫下，对膜荚黄芪产生的不利影响较小，可以保持正常生长。

Chl为叶绿体， P为嗜锇颗粒，G为基粒，S为淀粉粒，1～4号为膜荚黄芪，5～8号为蒙古黄芪，1、5号为内生真菌处理组，2、6号为盐碱胁迫组，3、7号为空白对照组，4、8号为遮光对照组。

图1不同处理对黄芪叶绿体超微结构的影响(17 000×)

在不同遮光率的黄芪超微结构研究中，膜荚黄芪叶绿体形状变为球形，类囊体数目减少，基粒片层溶解，边缘模糊，淀粉粒数量增多、直径明显增大。蒙古黄芪类囊体数目增多，基粒片层边缘清晰，淀粉粒几不可见。有利于捕获光能、减少自身对光的消耗，对其在弱光下生存具有重要意义[12-13]。

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Effect of Different Growth Environment on the Chloroplasts Ultrastructure ofAstragalus//

Zhang Yanhe, Ren Weichao, Yan Song, Liu Zhenpeng, Zhang Kaixue, Ma Wei

(Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(2)：15-17,25.

Astragalus; Ultrastructure; Shading rate; Salt stress; Endophytic fungus

张艳贺，女，1989年1月生，黑龙江中医药大学药学院，硕士研究生。E-mail:zyh_zyy2011@163.com。

马伟，黑龙江中医药大学药学院，研究员。E-mail:mawei@hljucm.net。

2015年9月11日。

R927.2

1)林业公益性行业科研专项(201004079，201404718)；国家自然科学基金(81274010)；黑龙江省杰出青年基金(JC201101)；黑龙江中医药大学“优秀创新人才支持计划”项目。

责任编辑：潘华。