HOXA1基因与先天性小耳畸形相关性研究

吴施楠 潘 博 张 晔 王 熙 王 晶 蒋海越 王彬彬*

1. 北京协和医学院研究生院(100730)；2.国家卫生计生委科学技术研究所；3.中国医学科学院整形外科医院；4.首都医科大学

HOXA1基因与先天性小耳畸形相关性研究

吴施楠1,2潘 博3张 晔3王 熙2王 晶4蒋海越3王彬彬1,2*

1. 北京协和医学院研究生院(100730)；2.国家卫生计生委科学技术研究所；3.中国医学科学院整形外科医院；4.首都医科大学

目的：研究同源框A1(HOXA1)基因与先天性小耳畸形之间是否存在关联，为小耳畸形的候选基因研究提供线索。方法：在HapMap数据库中选出HOXA1基因的标签SNP rs17449024，利用飞行时间质谱在1152例非综合征型小耳畸形(病例组)及1152例相匹配的健康对照中对该SNP位点进行基因分型，统计检验HOXA1与小耳畸形之间相关性。结果：Rs17449024的等位基因频率及基因型分布在病例组和对照组中不存在统计学差异(P=0.279、0.186)。在显性和隐性模型下也未观察到差异。结论：在本研究人群中，HOXA1基因与非综合征型小耳畸形之间不存在关联。还需利用多种方法探究该基因在小耳畸形发生中的作用。

先天性小耳畸形；HOXA1基因；标签SNP；关联分析研究

小耳畸形是一种颅面部先天性出生缺陷，该病的主要表型特征是小且异常的外耳廓形状及结构。大多数患者常伴有外耳道狭窄或闭锁等，少数患者会累及中耳，但内耳一般不受影响。小耳畸形表型的变化种类较多，轻度患者耳廓结构可见，仅少数几个耳廓标志物消失，重度患者的耳廓结构无法辨认，甚至表现为耳廓完全缺失(无耳畸形)。中国小耳畸形新生儿总发病率约为3.06/万，且呈不断上升的趋势[1]。世界范围内，该病新生儿的平均发病率为2.06/万[2]。可见我国小耳畸形的发病率高于世界平均水平，需引起重视。小耳畸形可单独发生，亦可伴随其他器官或组织畸形出现，基于此可将小耳畸形分为非综合征型和综合征型。常见的综合征型小耳畸形有LAMM综合征、Meier-Gorlin综合征及鳃耳肾(BOR)综合征等[3]。目前，小耳畸形的致病因素仍不清楚。研究表明，环境因素、母体因素及遗传因素都会导致小耳畸形的发生[3]。其中遗传因素在疾病发生中发挥重要作用，双生子研究结果提示我们，同卵双胞胎发生小耳畸形的一致率明显高于异卵双胞胎(38.5%比4.5%)，即同卵双胞胎患有耳部畸形的概率增加了30倍[4]。一些小耳畸形相关的遗传学研究已经发现，包括FGF3、ROBO1，EVC、EVC2、SLC2A9、NKX3-2以及HMX1等基因与小耳畸形发生之间存在关联[5-6]。综合多个研究结果来看，这些基因目前仅能解释部分患者的致病因素，在不同的研究人群中得到的结果不一致，因此小耳畸形的致病基因仍不明确，还需在大样本中进行深入研究。同源框A1(Homeobox A1，HOXA1)是HOX基因家族中的一员，该基因家族在胚胎的早期发育中发挥转录因子的作用，是一类非常重要的调控基因[7]。多年来，HOXA1基因一直被认为是小耳畸形的一个重要候选基因[8-9]，但在大样本量非综合征小耳畸形患者中进行的遗传学研究少见报道。为此，本研究中对HOXA1基因的标签SNP(tag SNP)与非综合征型小耳畸形在大样本人群中进行关联分析研究，以期发现该病新的研究思路。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

小耳畸形患者来自于中国医学科学院整形外科医院整形七科，所有患者均进行了耳部、颅面部及身体其他部位的严格检查。纳入无综合征表型，无其他慢性或重大疾病的非综合征型小耳畸形患者1152例作为本研究的病例组。随后按照整形外科医院整形七科多年经验建立的分类方法[10]将患者按照严重程度进行分为I、II、III度，并对患者的性别、患侧、外耳道受累等情况进行记录。对照样本来自该院体检中心，将无任何耳部畸形及其他先天性或慢性疾病的人群，按照性别、民族(全部研究对象均为汉族)相匹配的原则纳入1152例作为对照组。上述病例组和对照组中的研究对象均为不相关个体，彼此无血缘关系。本研究通过了国家卫生计生委科学技术研究所及中国医学科学院整形外科医院伦理委员会审查，所有实验项目均符合伦理规定。全部研究对象均由本人或监护人签署了知情同意书，EDTA抗凝管采集血液样本2ml，于-20℃保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 HOXA1基因tag SNP的选择 在HapMap数据库中查找HOXA1基因所在染色体的位置，在该位置的基础上在5'和3'端分别延长1000bp，并将此区域(chr7:27098141-27103150)作为挑选tag SNP的范围。随后在HapMap数据库中的tag SNP选择项栏，设置选择CHB， r2>0.8，最小等位基因频率(MAF)>0.05进行选择。最终得到HOXA1基因的tag SNP(rs17449024)进行后续研究。

1.2.2 飞行时间质谱实验 利用HiPure Blood DNA Mini Kit全基因组DNA提取试剂盒(广州美基生物科技有限公司)，从已收集的病例和对照血液样本中提取基因组DNA，检测各样本的浓度与纯度，按照实验要求将DNA稀释至10ng/μl，保证每个反应孔中的DNA浓度相近。将稀释好的DNA排板待用。利用AssayDesigner3.1 软件，结合文献设计反应引物。Rs17449024位点的引物如下：1st-PCR引物，ACGTTGGATGTTCAAGCTCGGAATGGAGGG；2nd-PCR引物，ACGTTGGATGTCTTTTCTTGCCCTCGTCTC，产物长度107bp。根据规定的实验体系加入反应试剂及DNA样本，依次进行PCR、SAP纯化反应及单碱基延伸反应，利用MassARRAY 系统(美国Sequenom公司)进行飞行时间质谱实验，得到rs17449024在每位研究对象中的分型数据。

1.3 统计分析

利用SPSS 19.0进行统计分析，采用卡方检验计算基因型分布及等位基因频率的差异，同时计算等位基因的OR值及95% CI，P<0.05时差异有统计学意义。病例组和对照组中的哈迪-温伯格平衡(HWE)利用在线计算软件OEGE-HWE calculator(http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml)计算，P>0.05则满足该平衡。

2 结果

2.1 研究对象的临床特征

本研究共纳入1152例非综合征型小耳畸形患者，其中I度192例，II度919例，III度(包括无耳畸形)41例，年龄为11.26±6.57岁；对照组年龄49.89±17.22岁。病例组和对照组中男女性别比例无差异(df=1，P=1.00)。病例组中男性患者比例是女性患者的3.2倍，多数患者是右侧受累。患者的外耳道大都有不同程度的狭窄或闭锁，见表1。

2.2 HOXA1基因tag SNP与非综合征型小耳畸形的关联

根据得到的基因分型数据可知，rs17449024位点在病例组和对照组中的分型率分别为99.22%和99.65%，均高于99%，分型成功，结果可信。病例组和对照组中的基因型分布满足哈迪-温伯格平衡，在OEGE上计算出的P>0.05。经卡方检验，rs17449024的等位基因频率及基因型分布在病例组和对照组中均无统计学差异，P值分别为0.279和0.186。随后又分别在显性和隐性模型下对每个位点进行了统计分析，也未见统计学差异。见表2。

表1 两组对象的临床资料[例(%)]

表2 HOXA1 tag SNP位点的等位基因频率和基因型分布

3 讨论

本研究是国内外首次在大样本量的非综合征型小耳畸形患者中对HOXA1基因与非综合征型小耳畸形的相关性进行探讨。结果表明HOXA1基因的tag SNP rs17449024的基因型分布和等位基因频率在病例组和对照组中无统计学差异，说明在本研究人群中，HOXA1基因与非综合征型小耳畸形不相关，该基因在小耳畸形的发生发展中的作用仍需多方面探讨。

本次纳入研究的非综合征型小耳畸形病例有1152例，从流行病学统计数据来看，本研究中病例组中的男女比例高达3.2:1，这一数值与中国两项研究得到的结果相近(72.75%和69.7%)[11-12]，但比芬兰(60.6%)、荷兰(60.8%)及韩国(56.6%)等地的男性比例高[13-15]。外耳道受累的患者比例(99.65%)也显著高于其他研究结果[13，16]。通过比较可知，我国小耳畸形男性患者比例、外耳道受累患者比例普遍高于其他国家，这也说明人群、地域等因素均会对小耳畸形造成影响。另外由于部分研究的时间较早，得到的数据与目前的流行病学数据可能存在出入。

HOXA1基因属于HOX基因家族中的HOXA簇，该家族编码的蛋白在胚胎早期发育及细胞增殖、分化中发挥关键作用[17]。HOXA1在胚胎早期第一、 二鳃弓部位的神经嵴细胞中有表达，而从发育生物学角度来看，中、外耳即是由第一、二鳃弓发育而来，这提示HOXA1可能是外耳发育中的关键转录因子。早在20世纪90年代，研究人员就在Hoxa1纯和缺失的小鼠模型中观察到，该基因缺失的小鼠外耳发育明显异常，耳廓大小异于正常小鼠，且中耳和内耳的发育和功能也受到影响[18-19]。Hoxa1 /Hoxb1 复合突变体小鼠则表现为无耳畸形，无外耳道，且在第10.5天时观察不到第二鳃弓[20]。但HOXA1基因在大规模的非综合征型小耳畸形人群中的遗传学研究较少，多集中在综合征研究，Tischfield，Bosley等人在临床表现包括畸形耳廓，如位置低下、耳轮扁平等在内的综合征患者中检测到了HOXA1的多个突变[21-22]。但由于HOXA1的保守性很强，在具有耳廓畸形的DRS综合征中，多项研究均未发现HOXA1突变[23-25]。与此结果相似，Alasti等人[26]在一个伊朗近亲小耳畸形家系中也并未检测到HOXA1的突变，而是在其同源的HOXA2基因中发现了一个错义突变。乔瑞敏[27]在家猪模型中通过芯片扫描及测序确认HOXA1突变能够解释猪耳大小，随后在146例散发小耳畸形中检测到了该基因的一个缺失突变，这是目前国内仅有的一项针对HOXA1基因进行突变筛查得到阳性结果的研究。

通过与上述这些研究的样本及结果相比较，结合本研究的数据结果，可以看出HOXA1基因与本研究中的非综合征型小耳畸形人群不存在相关性。一方面由于本研究中的患者来自全国各地，且绝大部分样本都是散发的，地域差异等非遗传因素均会对研究结果造成一定影响，使得HOXA1基因的遗传作用在本研究中未被发现。另一方面考虑到小耳畸形的发病过程复杂，从外耳发育的过程来讲，第一、二鳃弓及神经嵴细胞的增殖、分化、迁移等过程受多个信号分子或基因的调控，HOXA1可能不是导致小耳畸形唯一的致病基因。因此在本研究人群中，未发现该基因与非综合征型小耳畸形相关。从多项研究结果可以看出，目前得到的候选基因，如EVC、EVC2、HOXA2等[6，26]，多来自于家系连锁分析或突变筛查。基于这些研究现状及我们的分析结果，为了进一步探究HOXA1在小耳畸形发病中的作用，后续我们可以从非综合征小耳畸形的家系研究入手，重点进行家系中关联分析研究或HOXA1的突变筛查研究，继续深入探讨HOXA1基因与小耳畸形之间的关联，为小耳畸形的遗传学及致病基因的研究提供更多依据。

[1] Deng K, Dai L, Yi L, et al. Epidemiologic characteristics and time trend in the prevalence of anotia and microtia in China[J]. Birth defects research Part A, Clinical and molecular teratology. 2016, 106(2):88-94.

[2] Luquetti DV, Leoncini E, Mastroiacovo P. Microtia-anotia: a global review of prevalence rates[J]. Birth defects research Part A, Clinical and molecular teratology. 2011, 91(9):813-822.

[3] Luquetti DV, Heike CL, Hing AV, et al. Microtia: epidemiology and genetics[J]. American journal of medical genetics Part A. 2012, 158A (1):124-139.

[4] Artunduaga MA, Quintanilla-Dieck Mde L, Greenway S, et al. A classic twin study of external ear malformations, including microtia[J]. The New England journal of medicine. 2009, 361(12):1216-1218.

[5] Zhang YB, Hu J, Zhang J, et al. Genome-wide association study identifies multiple susceptibility loci for craniofacial microsomia[J]. Nat Communication. 2016, 7: 10605.

[6] Li X, Hu J, Zhang J, et al. Genome-wide linkage study suggests a susceptibility locus for isolated bilateral microtia on 4p15.32-4p16.2[J]. PLoS One. 2014, 9(7):e101152.

[7] Seifert A, Werheid DF, Knapp SM, et al. Role of Hox genes in stem cell differentiation[J]. World journal of stem cells. 2015, 7(3):583-595.

[8] 王大勇, 王秋菊. 先天性外中耳畸形基因学研究进展[J]. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志. 2013, 27(9):498-504.

[9] 吴荣薇, 潘博. 小耳畸形的流行病学和遗传学研究进展[J]. 中华临床医师杂志(电子版). 2013, 7(1):282-284.

[10] Wu R, Jiang H, Chen W, et al. Three-dimensional chest computed tomography analysis of thoracic deformities in patients with microtia[J]. Journal of plastic, reconstructive & aesthetic surgery: JPRAS. 2015, 68(4):498-504.

[11] Wu J, Zhang R, Zhang Q, et al. Epidemiological analysis of microtia: a retrospective study in 345 patients in China[J]. International journal of pediatric otorhinolaryngology. 2010, 74(3):275-278.

[12] Li CL, Chen Y, Shan J, et al. Phenotypic characterization and risk factors for microtia in East China, a case-control study[J]. International journal of pediatric otorhinolaryngology. 2014, 78(12):2060-2063.

[13] Suutarla S, Rautio J, Ritvanen A, et al. Microtia in Finland: comparison of characteristics in different populations[J]. International journal of pediatric otorhinolaryngology. 2007, 71(8):1211-1217.

[14] van Nunen DP, Kolodzynski MN, van den Boogaard MJ, et al. Microtia in the Netherlands: clinical characteristics and associated anomalies[J]. International journal of pediatric otorhinolaryngology. 2014, 78(6):954-959.

[15] Luquetti DV, Saltzman BS, Lopez-Camelo J, et al. Risk factors and demographics for microtia in South America: a case-control analysis[J]. Birth defects research Part A, Clinical and molecular teratology. 2013, 97(11):736-743.

[16] Okajima H, Takeichi Y, Umeda K, et al. Clinical analysis of 592 patients with microtia[J]. Acta oto-laryngologica Supplementum. 1996, 525(1):18-24.

[17] 金淑清, 浦予飞, 裘莹. HOX基因的研究进展[J]. 癌症进展. 2011, 9(2):154-158.

[18] Lufkin T, Dierich A, LeMeur M, et al. Disruption of the Hox-1.6 homeobox gene results in defects in a region corresponding to its rostral domain of expression[J]. Cell. 1991, 66(6):1105-1119.

[19] Chisaka O, Musci TS, Capecchi MR. Developmental defects of the ear, cranial nerves and hindbrain resulting from targeted disruption of the mouse homeobox gene Hox-1.6[J]. Nature. 1992, 355(6360):516-520.

[20] Gavalas A, Studer M, Lumsden A, et al. Hoxa1 and Hoxb1 synergize in patterning the hindbrain, cranial nerves and second pharyngeal arch[J]. Development. 1998, 125(6):1123-1136.

[21] Tischfield MA, Bosley TM, Salih MA, et al. Homozygous HOXA1 mutations disrupt human brainstem, inner ear, cardiovascular and cognitive development[J]. Nature genetics. 2005, 37(10):1035-1037.

[22] Bosley TM, Salih MA, Alorainy IA, et al. Clinical characterization of the HOXA1 syndrome BSAS variant[J]. Neurology. 2007, 69(12):1245-1253.

[23] Abu-Amero KK, Kondkar AA, Salih MA, et al. Partial chromosome 7 duplication with a phenotype mimicking the HOXA1 spectrum disorder[J]. Ophthalmic genetics. 2013, 34(1-2):90-96.

[24] Abu-Amero KK, Kondkar AA, Al Otaibi A, et al. Partial duplication of chromosome 19 associated with syndromic duane retraction syndrome[J]. Ophthalmic genetics. 2015, 36(1):14-20.

[25] Abu-Amero KK, Kondkar A, Hellani AM, et al. Nicotinic Receptor Mutation in a Mildly Dysmorphic Girl with Duane Retraction Syndrome[J]. Ophthalmic genetics. 2015, 36(2):99-104.

[26] Alasti F, Sadeghi A, Sanati MH, et al. A mutation in HOXA2 is responsible for autosomal-recessive microtia in an Iranian family[J].American journal of human genetics. 2008, 82(4):982-991.

[27] 乔瑞敏. 以家猪为模型解析先天性外耳发育畸形的遗传机制[D]. 南昌：江西农业大学, 2014：52-54.

[责任编辑：董 琳]

Association study between HOXA1 gene and congenital microtia

WU Shinan1,2, PAN Bo3, Zhang Ye3, WANG Xi2, WANG Jing4, JIANG Haiyue3, WANG Binbin1,2

1.GraduateSchoolofPekingUnionMedicalCollege,Beijing, 100730；2.NationalResearchInstituteforFamilyPlanning; 3PlasticSurgeryHospital,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege; 4TheCapitalMedicalUniversity,Beijing

*Correspondingauthor:wbbahu@163.com

Objective: To explore whether HOXA1 gene associated with congenital microtia and to provide clues for candidate gene study of microtia. Methods: One tag SNP (rs17449024) of HOXA1 was selected from Hapmap database, and genotyping were detected by using Time of Flight Mass Spectrometry (TOF MS) in 1152 nonsyndromic microtia patients and 1152 healthy controls. The association between HOXA1 and microtia was analyzed by chi-square test. Results: There was no significant difference in allele frequency and genotypic distribution of rs17449024 between patients in observation group and control group (Pvalue was 0.186 and 0.276, respectively). Significant differences were not observed in both recessive and dominant modes. Conclusion: The results showed that HOXA1 gene is not associated with nonsyndromic microtia. So other various methods were further used to explore the role of HOXA1 gene in nonsyndromic microtia patients.

Congenital microtia; HOXA1 gene; Tag SNP; Association study

国家自然科学基金(编号：81571863，81272124)；首都医科大学基础临床科研合作课题(编号：13JL22)

2016-05-16

2016-06-02

10.3969/j.issn.1004-8189.2016.

*通讯作者：wbbahu@163.com