不同浓度葛根素溶液对人皮肤成纤维细胞生物学效应的影响*

岳冬梅，阎　冰，马轶文，王益民，孟庆楠

（1.天津中医药大学，天津，300193；2.天津市滨海新区塘沽妇产医院，天津300451）

不同浓度葛根素溶液对人皮肤成纤维细胞生物学效应的影响*

岳冬梅1，阎冰1，马轶文2，王益民1，孟庆楠1

（1.天津中医药大学，天津，300193；2.天津市滨海新区塘沽妇产医院，天津300451）

［目的］观察不同浓度的葛根素溶液对人皮肤成纤维细胞（HDF）生物学效应的影响。［方法］体外培养人皮肤成纤维细胞，选用葛根素溶液100、200、300、400、500 μg/mL五个不同的药物浓度，观测葛根素溶液在5个药物浓度下对HDF的生物学效应的影响。［结果］与对照组相比较，药物浓度为100、200、300、400 μg/mL的葛根素溶液，对体外培养的HDF的生物学效应无影响（P＞0.05）；药物浓度为500 μg/mL的葛根素溶液，对体外培养的HDF的增殖有抑制作用（P＜0.05），且对HDF的细胞膜有一定的损伤作用（P＜0.05）。［结论］药物浓度500 μg/mL的葛根素溶液对体外培养的HDF有抑制增殖和细胞膜损伤的作用，此药物浓度可作为干预HDF的作用剂量，对瘢痕组织的治疗将起到一定作用。

葛根素；人皮肤成纤维细胞；药物浓度；生物学效应

葛根素为黄酮类化合物，是豆科植物野葛或甘葛藤的有效成分之一，主要用于治疗心脑血管系统疾病等［1-2］。研究报道［3］葛根素溶液在药物浓度80～400 μg/mL下，作用于人胚肺成纤维细胞24～72 h，此时间范围内，葛根素在依赖时间和剂量的前提下可抑制其增生（P＜0.05），本研究借鉴前人经验，选用体外培养人皮肤成纤维细胞（HDF）的方法，选用葛根素从低到高五个不同的药物浓度作研究，观测葛根素注射液在浓度递增的情况下对人皮肤成纤维细胞的增殖活性、细胞膜、氧化损伤产生的影响，对比分析前后实验结果，选择出最佳药物剂量，为后序的研究提供参考。

1　材料与方法

1.1实验细胞人皮肤成纤维细胞株（HDF，美国

ATCC公司）。

1.2实验试剂葛根素注射液（浓度：5 g/L，山东莱阳生物化学制药厂）；；优级胎牛血清（FBS）、胰酶（美国Gibco公司）、DMEM低糖培养粉（美国Gibco

公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT，美国Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司）；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（中生北控生物有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程有限公司）。

1.3检测仪器酶标仪（奥地利SUNRISE）；全自动生化分析仪（日本日立公司）。

1.4实验分组空白组（只含培养基）、对照组（培养基+细胞）、葛根素组。葛根素组药物浓度依次为：100 μg/mL（1组）、200 μg/mL（2组）、300 μg/mL （3组）、400 μg/mL（4组）、500 μg/mL（5组），共设5个浓度组。

1.5检测指标主要检测HDF的形态学变化、MTT、LDH、SOD、MDA值。

1.6细胞培养及指标检测

1.6.1HDF的培养对HDF进行复苏，将其转移到细胞培养瓶中，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基进行培养，放置于37℃、含5%二氧化碳（CO2）的培养箱中，待细胞铺满瓶壁时，用0.25%胰蛋白酶，对HDF进行消化并传代，采用处在对数生长期（LP）的细胞进行本次实验。

1.6.2检测细胞MTT值用混合消化液消化80%融合生长的HDF，收集处理后的细胞，用含有10% FBS的DMEM培养基接种于96孔板，密度为2× 104/每孔，每孔100 μL，正常培养12 h后，使细胞贴壁。实验设空白组、对照组、葛根素药物组。药物组每组各加入葛根素注射液（原浓度5 g/L）2、4、6、8、10 μL，令葛根素溶液的药物浓度，依次为：100 μg/mL （1组）、200μg/mL（2组）、300μg/mL（3组）、400μg/mL （4组）、500 μg/mL（5组），共设5个浓度组，每组包含12个复孔。培养48 h后，移出培养液，换入磷酸盐缓冲溶液（PBS液，pH7.2-7.4），100 μL/孔，清洗2遍，移出PBS液，并于每孔中加入MTT（5 g/L）20 μL，孵育4 h后，将MTT溶液移出，在每个孔中，加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，为使结晶物彻底溶解，将96孔板放于摇床上，低速振摇10 min，待结晶物完全溶解后，用酶标仪于570 nm波长检测各组的光密度值（Optical Density，OD值）。

1.6.3检测细胞LDH、SOD、MDA值将HDF以细胞密度5×104/mL种植于24孔板，分为空白组、对照组、5个不同浓度药物组（同上），每组12个复孔，放入细胞培养箱中，培养48 h后，取细胞上清液，使用LDH试剂盒，在全自动生化仪上检测细胞外的LDH值；使用SOD试剂盒，检测细胞外的SOD值；使用MDA试剂盒，检测细胞外的MDA值。

1.7统计学分析采用统计软件SPSS18.0分析，计量资料以均数±标准差（±ss）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P< 0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1药物干预下HDF的生长状态和形态学的改变使用倒置显微镜，观测到对照组HDF的形状为长梭形，葛根素注射液组（药物组）HDF的间隙，相比对照组有所增大，HDF生长的略显缓慢。

2.2不同浓度的葛根素溶液对HDF增殖的影响结果见表1。

表1　不同浓度的葛根素溶液对HDF增殖的影响（±ss）Tab.1　Effects of puerarin solution of different concentrations on HDF proliferation（±ss）

表1　不同浓度的葛根素溶液对HDF增殖的影响（±ss）Tab.1　Effects of puerarin solution of different concentrations on HDF proliferation（±ss）

注：与对照组比较，*P<0.05。

组别　OD值空白组　0.075±0.022对照组　0.125±0.02 1组　0.131±0.028 2组　0.142±0.041 3组　0.127±0.028 4组　0.112±0.018 5组　0.105±0.013* n 药物浓度（μg/mL）12 12 12 12 12 12 12 0 0 100 200 300 400 500

由表1可见，与对照组细胞的OD值相比较，葛根素溶液的药物浓度依次为100、200、300、400μg/mL时，差异均无统计学意义；与对照组的OD值相比较，当葛根素溶液的药物浓度达到500 μg/mL时，差异有统计学意义（P<0.05），显示药物浓度500 μg/mL的葛根素溶液，对体外培养的HDF具有抑制增殖的作用。

2.3不同浓度的葛根素溶液对HDF乳酸脱氢酶的影响结果见表2。

表2　不同浓度的葛根素溶液对HDF乳酸脱氢酶的影响（±ss）Tab.2　Effects of puerarin solution of different concentrations on LDH of HDF（±ss）

表2　不同浓度的葛根素溶液对HDF乳酸脱氢酶的影响（±ss）Tab.2　Effects of puerarin solution of different concentrations on LDH of HDF（±ss）

注：与对照组比较，*P<0.05。

组别空白组对照组1组2组3组4组5组n 12 12 12 12 12 12 12药物浓度（μg/mL）　LDH值（U/L）0 40.92±2.50 0 52.92±2.81 100　53.58±2.56 200　54.83±3.58 300　55.58±3.23 400　56.38±3.22 500　60.92±2.59*

乳酸脱氢酶（LDH）是稳定的胞浆酶，它存在于所有的细胞当中，当细胞膜收到损伤时，它会快速释放到细胞培养液中。由表2可见，与对照组细胞的LDH值相比较，葛根素溶液的药物浓度依次为100、200、300、400 μg/mL时，差异均无统计学意义（P>0.05）；与对照组的LDH值相比较，当葛根素溶液的药物浓度达到500μg/mL时，差异有统计学意义（P<0.05），显示药物浓度500 μg/mL的葛根素溶液，对体外培养的HDF的细胞膜具有一定的损伤作用。

2.4不同浓度的葛根素溶液对HDF氧化损伤的影响结果见表3。

表3　不同浓度的葛根素溶液对HDF氧化损伤的影响（±ss）Tab.3　Effects of puerarin solution of different concentrations on oxidative damage of HDF（±ss）

表3　不同浓度的葛根素溶液对HDF氧化损伤的影响（±ss）Tab.3　Effects of puerarin solution of different concentrations on oxidative damage of HDF（±ss）

组别空白组对照组组组组组组n 12 12 12 12 12 12 12药物浓度（μg/mL） SOD值（U/L）MDA值（μmol/L）0 15.23±2.26　0.65±0.023 0 20.17±1.92　0.89±0.024 100　21.32±2.28　0.92±0.031 200　20.42±1.41　0.91±0.028 300　21.27±1.58　0.89±0.027 400　20.67±2.18　0.91±0.025 500　22.15±2.13　0.92±0.026 1 2 3 4 5

由表3可见，与对照组细胞的SOD值、MDA值相比较，葛根素溶液的药物浓度依次为100、200、300、400、500μg/mL时，差异均无统计学意义（P>0.05）。细胞的SOD值、MDA值代表了细胞的氧化损伤状态，显示上述药物浓度的葛根素溶液，对体外培养的HDF的氧化损伤无影响。

3　结论

与对照组相比较，药物浓度500 μg/mL的葛根素溶液，对体外培养的HDF的增殖有抑制作用，对细胞膜有一定的损伤作用。

4　讨论

中医记载，葛根具有退热发汗、解肌、止泻、止渴等作用效果，其药理活性较强，安全性高，且自然资源丰富、价格低廉，因此其临床应用越来越广泛［4］。葛根素之于葛根，其成分更加单纯，药效精专，药理活性也相对较强，现已普遍应用于心脑血管等疾病的治疗，葛根素还可抑制醛糖还原酶（AR）的活性［5］，又可抑制脂质（Lipide）的过氧化改变，促使超氧离子的自由基得到消除，因此可用其保护血管内皮，具体应用时应药理作用与临床相结合［6-8］。

实验结果表明：与对照组比较，葛根素溶液的药物浓度为100、200、300、400 μg/mL时，对人皮肤成纤维细胞的增殖、细胞膜、氧化损伤无影响（P＞0.05）；当葛根素溶液的药物浓度为500 μg/mL时，在一定程度上可以抑制HDF的增殖，对其细胞膜有一定程度的损伤作用（P＜0.05）。显示葛根素对HDF的生物学效应与药物浓度相关，药物浓度不同，其作用效果也不同。本实验所得数据，与之前的研究报道（80～400 μg/mL药物浓度葛根素，可抑制人胚肺成纤维细胞的增生，呈时间和剂量依赖性）所得的实验结论不同，分析可能是细胞种类不同，对葛根素药理作用的敏感性不同，实验结果有所差异［9-11］。

人皮肤成纤维细胞（HDF）是皮肤真皮网织层（reticular layer of dermis）中最重要的细胞，是皮肤受损后的主要修复细胞，在瘢痕组织（scar tissue）的形成中起到重要作用［12］。可以选择药物浓度500 μg/mL的葛根素溶液，作为干预HDF增殖的作用剂量，对瘢痕组织的治疗将起到一定作用。可对葛根素进一步进行瘢痕组织治疗效果的研究。

［1］杨亚勤.葛根素的药理作用及临床应用分析［J］.中国民康医学，2015，27（8）:91-92.

［2］瑙珉.葛根素药理作用研究进展［J］.黑龙江科技信息，2014，18（32）:85-85.

［3］解克芳，王继峰，牛建昭.葛根素对人胚肺成纤维细胞增殖及细胞外基质合成的影响［J］.中国中医药信息杂志，2008，15（5）: 39～40.

［4］刘淑霞，段惠军，张玉军，等.葛根素对糖尿病大鼠肾功能及肾组织MMP-3、TIMP-1表达的影响［J］.天然产物研究与开发，2013，13（10）:52.

［5］潘洪平，杨嘉珍，李吕力，等.葛根素注射液对急性血瘀模型大鼠血液流变性改善作用的实验研究［J］.中国中药杂志，2013，34 （19）:19.

［6］伟唯，江培.葛根素药理作用研究进展［J］.黑龙江医药，2014，27（1）:54.

［7］宋卉，李银花，郑晖，等.葛根素的药理作用与临床研究进展［J］.现代医药卫生，2011，27（19）:2936-2937.

［8］刘扬，庞妩燕.葛根素对实验性2型糖尿病小鼠血糖的影响［J］.中国现代药物应用，2011，5（17）:52-53.

［9］孙玉敏，许晓琳，杨怡等.葛根素可促进老年女性骨质疏松症患者成骨细胞的增殖［J］.中国组织工程研究，2015，19（29）:4593-4597.

［10］朱远军，金敏.葛根素对兔视网膜缺血/再灌注损伤中细胞凋亡的保护作用［J］.广州医药，2015，46（4）:9-13.

［11］王占美，赵园，陈健伟，等.葛根素对热应激诱导的LLC-PK1细胞HSP70表达的影响［J］.华北农学报，2014，29（3）:32-35.

［12］杨子良，骆丹，林秉奖.绿茶多酚对人皮肤成纤维细胞UVA氧化损伤的保护作用及机制研究［J］.中国中西医结合皮肤性病学杂志，2014，13（4）:207-209.

（本文编辑：高杉，张震之）

Biological effects of different concentrations of Puerarin solution on human skin fibroblast

YUE Dong-mei1，YAN Bing1，MA Yi-wen2，WANG Yi-min1，MENG Qing-nan1
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tanggu Maternity Hospital of Tianjin Binhai New Area，Tianjin 300451，China）

［Objective］To observe biological effects of different concentrations of puerarin solution on proliferation of human skin fibroblasts（HDF）.［Methods］Cultivated human skin fibroblasts in vitro，observed biological effects of puerarin solutions of 100，200，300，400，500 μg/mL five different drug concentrations on HDF.［Results］Compared with control group，drug concentration of 100，200，300，400 μg/mL of puerarin solution had no influence on biological effects of HDF.Drug concentration of 500 μg/mL of puerarin solution inhibited proliferation of HDF，had a certain damage on cell membranes of HDF.［Conclusion］Puerarin solution of 500 μg/mL can inhibit proliferation of HDF and have damage on cell membranes of HDF cultured in vitro，this drug concentration can be used as the dose of HDF intervention，will play a role in treatment of scar tissue.

Puerarin；human skin fibroblasts；drug concentration；biological effect

R285.5

A

1672-1519（2016）05-0311-03

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.05.14

国家自然科学基金项目（30873467）。

岳冬梅（1988-），女，硕士研究生，主要从事中医工程学研究。

孟庆楠，E-mail：mqn1234@163.com；王益民，E-mail: ylzmyh@163.com。

2015-11-28）