Pyrrosia petiolosa内生细菌筛选及其抑菌活性物质分析

杨小帆，宋丽菊，齐盼盼，吴道艳，闵　霞，李彩云，彭静珊，赵　建

（四川大学生命科学学院资源微生物及微生物生物技术重点实验室，四川 成都 610064）

Pyrrosia petiolosa内生细菌筛选及其抑菌活性物质分析

杨小帆，宋丽菊，齐盼盼，吴道艳，闵霞，李彩云，彭静珊，赵建

（四川大学生命科学学院资源微生物及微生物生物技术重点实验室，四川 成都 610064）

为探究Pyrrosia petiolosa内生细菌的抑菌活性，采用植物组织分离和微生物传统培养法从其根、茎、叶共分离检测到内生细菌14株。通过滤纸片抑菌法筛选两株有显著抑菌活性的内生细菌G7、Y12，并借助GC-MS技术对这两株内生细菌进行抑菌活性成分检测与分析。研究表明：两株内生细菌经16S rDNA测序比对分别鉴定为Lysinibacillus sphaericus C3-41和Bacillus amyloliquefaciens FZB42。生长曲线测定结果显示菌株G7、Y12分别在16h和12h后进入稳定期。GC-MS检测鉴定到两株内生细菌发酵上清抑菌活性物质主要是有机酸类和2，5-二酮哌嗪衍生物。该研究可为挖掘P.petiolosa内生细菌药物活性、筛选抗菌药物新来源提供参考。

有柄石韦；内生细菌；抑菌活性；GC-MS检测；代谢产物

0　引　言

有柄石韦（Pyrrosia petiolosa（Christ）Ching）始载于《神农本草经》，为水龙骨科石韦属植物，其味苦、甘，性微寒，含里白烯、β-谷甾醇、蔗糖、绿原酸、黄酮、芒果甙、木犀草素等多种活性成分［1］。P.petiolosa主治哮喘、肺脓疡、肾炎水肿、膀胱炎、泌尿系结石、咯血、吐血和尿血等临床病症［2］，有镇咳祛痰、降低血糖活性、抗病毒、抑菌消炎、增强免疫力等作用［3］，是复方石韦胶囊的一味重要中药材。P.petiolosa在中国东北、华北、西北、西南和长江中下游地区均有分布，朝鲜和俄罗斯也有少量分布，是石韦中药材的主要基源植物。P.petiolosa多系野生，该属植物大多数附生于树上或岩石上，少数生于土中，而且其人工培育对于土壤、排水、光照等条件要求苛刻［4］。目前，在国内外尚无关于P.petiolosa快速繁殖的报道，无节制的开采利用最终将导致P.petiolosa资源的枯竭。

植物内生细菌生活在健康植物的根、茎、叶、果实等组织中，与植物形成互利共生，是植物微生态系统的天然组成成分，具有作为植物次生代谢物基因工程生产菌的潜力，也是一个巨大的抗菌活性物质库，应当予以充分开发［5］。Abdallah等［6］从光烟草（Nicotiana glauca）中分离到的内生细菌对镰刀菌萎蔫病有生防作用并能促进西红柿生长。Kukla等［7］研究发现多年生黑麦草（Lolium perenne）中内生细菌的多样性具有降解石油烃类和促进植物生长的潜能。Ma等［8］研究证明伴矿景天（Sedum plumbizincicola）内生细菌能够吸附重金属离子，修复污染的土壤。因此，开展P.petiolosa内生细菌的研究，寻找其药用功能替代菌，为合理开发P.petiolosay药用和内生细菌资源具有重要的意义。

医院调查报告显示：手术和创伤伤口感染的细菌中，大肠杆菌（Escherichia coli）所占的比例为50%，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）所占的比例为16.67%［9］。另外，藤黄微球菌（Micrococcus luteus）可引起伤口等局部组织感染，肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）也是目前世界上最常见的食源性病原菌之一［10］。本实验探究了P.petiolosa内生细菌对这4株病源微生物的抑菌作用并检测分析其抑菌活性物质，对于挖掘有抑菌活性的内生细菌并提取其有效物质具有参考价值。

1　材料和方法

1.1材料

新鲜P.petiolosa根、茎、叶，采自四川省阿坝藏族羌族自治州汶川县绵虒镇，由四川大学生命科学学院鉴定，于采集后24h内进行内生细菌的分离。

供试细菌：肠炎沙门氏菌（S.enteritidis）、藤黄微球菌（M.luteus）、大肠杆菌 （E.coli）、金黄色葡萄球菌（S.aureus），均由四川省资源微生物与微生物生物技术重点实验室保藏。

1.2方法

1.2.1内生细菌分离

将采集的新鲜P.petiolosa的根、茎、叶表面以无菌水冲洗干净，依次用75%（ν∶ν）的酒精溶液浸泡2 min，有效氯5.2%的次氯酸钠溶液浸泡5 min，无菌水冲洗6～8次，然后用无菌剪刀切成2～3cm的小段，切口向下分别置于LB培养基平板上，以最后一次的洗涤水和表面灭菌的完整植株材料为对照，37℃培养3～7 d，根据菌株的形态、生长速度依次分离并于4℃保存［11］。

1.2.2内生细菌发酵液预处理

将分离得到的细菌菌株接种至300 mL LB液体培养基中，37℃摇床培养24h。之后将细菌发酵液5 000 r/min，离心2 min，收集发酵液上清（菌体沉淀备用），加入等体积的乙酸乙酯室温震荡过夜。菌体沉淀用PBS洗涤、重悬，并进行超声破壁（功率120W，超声4 s，停4 s，400个循环），破壁后的菌悬液加入等体积的乙酸乙酯室温震荡过夜。使用分液漏斗萃取分离发酵液上清和菌体沉淀的乙酸乙酯过夜浸泡液，得到乙酸乙酯上层萃取液，利用R-201旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司）分别真空浓缩至10mL制备成待测样品溶液。将发酵液上清、菌体沉淀、LB培养基的乙酸乙酯提取液（酯提液）分别用0.22μm滤头过滤备用。

1.2.3内生细菌产物抑菌活性测定

采用滤纸片抑菌法检测内生细菌的抑菌活性。将过夜活化的4株供试菌株用无菌水稀释至浊度为0.5个麦氏单位（108CFU/mL），取100μL菌悬液涂布至LB平板。滤纸片置于涂布供试菌的平板表面后，将待测样品分别加样50μL于滤纸片上，37℃恒温培养16h后测量抑菌圈直径，其中乙酸乙酯和LB培养基酯提液作为对照组。

1.2.4内生细菌16S rDNA序列测定与分子鉴定

使用细菌基因组提取试剂盒（Tian Gen）提取内生细菌的基因组DNA，PCR仪 （Analytik Jena，Easy Cycler 96）进行16S rDNA扩增。以27F（5＇-AGAGTT TGATCCTGGCTC-3＇）、1492R（5＇-CTACGGCTACCTT GTTACGA-3＇）为16S rDNA引物。50μL反应体系：Premix TaqRVersion 2.0（TaKaRa，Japan）25 μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR扩增条件：94℃ 5min；94℃变性30s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。对16S rDNA PCR反应产物进行测序，结果与NCBI数据库进行BLAST比对鉴定细菌种属。

1.2.5内生细菌生长曲线测定

将过夜活化的内生细菌接种于6mL LB液体试管内37℃、160 r/min培养0～24 h，每两小时取样使用紫外分光光度计（UV-Probe，日本岛津公司）测定发酵液OD600nm的吸光度。

1.2.6内生细菌发酵液GC-MS检测与抑菌活性物质分析

过滤除菌的待测样品使用QP2010气相色谱-质谱联用仪（GC-MS，日本岛津公司）进行活性成分检测。仪器设置：柱箱温度40℃；进样温度290℃；压力49.5kPa；程序性升温，40℃保持5min，以10℃/min升至100℃，保持5min，以5℃/min升至225℃，保持5min，以5℃/min升至250℃，保持2min，以10℃/min升至300℃，保持10min；总流量19.0mL/min；柱流量1.00mL/min；线速度36.1cm/s；吹扫流量3.0mL/min；分流比15∶1。

1.2.7统计分析

试验结果以均值±标准误差表示，采用SPSS Statistics V17.0软件的One-way ANOVA进行方差分析，P≤0.05视为具有显著性差异。

2　结果与分析

2.1内生细菌分离

从P.petiolosa的根（G）、茎（J）、叶（Y）中分离到内生细菌 G1，G3，G4，G5，G6，G7，G8，G9，G21，J2，J4，J11，Y11，Y12共14株，其中根部9株，茎部3株，叶部2株。根部分离到的内生菌株数最多，占总菌株数的64.3%。

2.2内生细菌产物抑菌活性测定

对P.petiolosa中分离到的14株内生细菌进行发酵液抑菌活性的测定，筛选得到内生菌株G7、Y12，利用滤纸片抑菌法对两株内生细菌发酵液、发酵液乙醇提取液（醇提液）、发酵液酯提液进行抑菌活性检测，结果表明菌株G7、Y12发酵液酯提液抑菌效果最显著。菌株G7、Y12发酵液酯提液与对照组相比，对4株供试菌株均有显著的抑菌活性（P≤0.05）（见表1）。其中，G7发酵上清酯提液对S.aureus抑菌圈直径达到（11.667±0.675）mm，Y12发酵上清酯提液对E.coli抑菌圈直径达到 （14.697±1.874）mm，说明这两株内生细菌发酵上清酯提液均对手术和创伤感染的主要病原菌具有显著的抑菌作用。同时，菌株G7、Y12发酵上清酯提液相比于菌体沉淀酯提液对4株供试菌株均具有更显著的抑菌活性（P≤0.05），说明内生细菌G7、Y12的抑菌活性物质主要为胞外分泌物，并且可溶于乙酸乙酯。

2.3内生细菌16S rDNA序列测定与分子鉴定

基于抑菌活性的研究，筛选得到菌株G7、Y12后，对其16S rDNA进行序列测定。内生菌株G7、Y12 的16S rDNA碱基大小分别为1 417 bp和1 427 bp，通过序列比对发现菌株G7、Y12分别与球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericus C3-41）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens FZB42）具有99%以上的序列同源性（见表2）。

表1　内生细菌G7、Y12产物对供试细菌的抑菌圈直径1）-2）mm

表2　菌株G7、Y12 16S rDNA序列与NCBI数据库BLAST比对结果

2.4内生细菌生长曲线测定

为对两株内生细菌的生长状态有更加明确的认识，绘制了内生细菌的生长曲线（见图1）。在0～24h内，G7菌株的延滞期、对数期、稳定期和衰亡期分别为0～4 h，4～16 h，16～20 h，20～24 h；Y12菌株的延滞期、对数期、稳定期和衰亡期分别为0～4 h，4～12 h，12～20h，20～24h。

2.5内生细菌发酵液GC-MS检测与抑菌活性物质

分析

由抑菌结果可知，两株内生细菌发酵上清酯提液相比于菌体沉淀酯提液对4株供试菌株具有更显著的抑菌活性（P≤0.05），因此对这两株内生细菌的发酵上清酯提液进行GC-MS检测。菌株G7、Y12发酵上清酯提液分别检测到78，75个峰。在去除LB培养基酯提液所得到的物质后，菌株G7、Y12发酵上清酯提液中分别检测到33，32种物质（见表3、表4）。对GC-MS检测得到的物质进行成分分析，发现物质种类主要为酯类、酸类、醇类、酮类、烷烃类、芳香烃类、哌嗪类、酰胺类（如图2所示）。在G7菌株发酵上清酯提液中，相对含量较多的物质类别为酮类、哌嗪类、烷烃类，分别占总物质的15.43%、4.57%、3.69%，其物质种类也相对丰富。其中，3-羟基-3-甲基-2-丁酮含量最高，为13.17%，可用于医药中间体的研发合成和生产。在Y12菌株发酵上清酯提液中，相对含量最多的物质为酸类、烷烃类、醇类，分别占总物质的8.20%、3.22%、1.70%；数量最多的物质为酸类、烷烃类、哌嗪类，其中，有机酸3-甲基-异戊酸含量最高，占总物质的6.51%，可用于制药和香料合成。

图1　内生细菌G7、Y12的生长曲线

表3　菌株G7发酵上清酯提物GC-MS检测

3　讨　论

P.petiolosa作为重要的中药资源，已有诸多报道称其具有消炎利尿、清湿热等功能，且其化学成分和药理活性也得到了深入的研究［1，12-13］，但对于P.petiolosa内生细菌发酵液的抑菌活性和有效成分的检测还未见报道。本研究从P.petiolosa的根、茎、叶共检测得到14株内生细菌，通过对其进行抑菌活性筛选，发现菌株 G7、Y12发酵上清酯提液对于4株供试菌株均具有显著的抑菌效果，分别鉴定为L.sphaericusC3-41、B.amyloliquefaciens FZB42。已有文献报道L.sphaericus是目前研究最为深入，在我国应用最广泛的生物杀虫剂［14］，B.amyloliquefaciens具有较强次级代谢产物的生产能力，可以产生多种抑菌相关的代谢产物［15］，而对于它们的发酵上清酯提液抑菌活性分析和活性物质检测还是首次研究。

表4　菌株Y12发酵上清酯提物GC-MS检测

图2　菌株G7、Y12发酵上清酯提液物质分析

本研究利用GC-MS技术检测了菌株G7、Y12发酵上清酯提液的物质成分，其中酮类、烷烃类、酸类、哌嗪类化合物的相对含量较高，物质种类也相对较多，酸类物质主要为有机酸，哌嗪类物质主要为2，5-二酮哌嗪衍生物。已有研究报道称云杉针叶水提物及松针醇提取物中主要抑菌物质为有机酸［16-17］。有机酸可作为牛肉辅料添加剂抑制大肠杆菌等病原微生物［18］，并且在一定浓度下对常见的细菌和真菌有良好的抑制作用，尤其对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和华根霉的抑制效果较为明显［19］。2，5-二酮哌嗪衍生物不仅具有广谱的抗菌活性，能显著降低多种抗生素对多种耐药菌的最低抑制浓度，从而恢复实验细菌对相应抗生素的敏感性［20］；同时具有抗肿瘤、脱瘾与解毒活性，可保护神经元，改善脑功能，对心血管系统和细胞间信号传导也有重要的作用；还可作为植物生长调节剂［21］。综上所述，G7菌株发酵上清酯提液抑菌活性物质主要包括有机酸类1.16%，2，5-二酮哌嗪衍生物4.57%。Y12发酵上清菌株酯提液抑菌活性物质主要包括有机酸类8.2%，2，5-二酮哌嗪衍生物1.37%。

4　结束语

本研究成功筛选到的两株P.petiolosa内生细菌L.sphaericus C3-41和B.amyloliquefaciens FZB42，对手术和创伤伤口感染以及食源性污染主要病原菌具有显著的抑制效果。研究结果对于挖掘具有临床医学意义的工程菌、开发有机酸类和2，5-二酮哌嗪衍生物等抗菌药物、合理利用P.petiolosa等中药资源具有参考价值。

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（编辑：莫婕）

Screening of endophytic bacteria in Pyrrosia petiolosa and analysis of its antimicrobial active ingredients

YANG Xiaofan，SONG Liju，QI Panpan，WU Daoyan，MIN Xia，LI Caiyun，PENG Jingshan，ZHAO Jian
（Key Laboratory of Microbiological Resource and Technology，College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064，China）

In order to study antimicrobial activity of endophytic bacteria in Pyrrosia petiolosa，plant tissue separation and traditional microbial culture methods were employed，by which fourteen bacteria strains were isolated from the roots，stems and leaves of P.petiolosa.Endophytic bacteria G7 and Y12 were screened out due to their significant antimicrobial activity through filter paper bacteriostatic method.The antimicrobial active ingredients were detected and analyzed by GC-MS technology.Strains G7 and Y12 were identified as Lysinibacillus sphaericus C3-41 and Bacillus amyloliquefaciens FZB42 respectively according to the 16S rDNA sequence analysis.Growth curves of strains G7 and Y12 showed that the stationary phase begins after 16h and 12h，respectively. The antimicrobial active materials mainly consisted of organic acids and 2，5-piperazinedione derivative through GC-MS detection.The study laid an research foundation for discovering the pharmaceutical activity of endophytic bacteria in P.petiolosa and screening a new source of antimicrobial agents.

P.petiolosa；endophytic bacteria；antimicrobial activity；GC-MS analysis；metabolites

A

1674-5124（2016）07-0047-06

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.07.010

2016-02-03；

2016-03-10

国家自然科学基金（31270175）；教育部新世纪人才和川大优秀青年学者项目（NCET-13-0397，2013SCU04B14）

杨小帆（1991-），女，湖北安陆市人，硕士研究生，专业方向为资源微生物应用。

赵建（1976-），男，江苏扬州市人，教授，博士，主要从事资源微生物及微生物天然免疫研究。