小麦单片叶片DNA 提取及SSR-PCR

丁 晨

(大庆师范学院生物工程学院，黑龙江大庆 163712)



小麦单片叶片DNA 提取及SSR-PCR

丁 晨

(大庆师范学院生物工程学院，黑龙江大庆 163712)

[目的]使用PCR扩增鉴定哪些微卫星引物可用于鉴定小麦遗传背景下的黑麦遗传成分。[方法]以小麦单片叶片为材料，采用CTAB法提取DNA，以获得的DNA为模板进行SSR-PCR扩增，再进行普通小麦与黑麦之间多态性引物筛选，筛选出可用于鉴定小麦遗传背景下的黑麦遗传成分的引物。[结果]在所研究的20对SSR引物中，有 18 对在普通小麦与黑麦之间扩增出的产物有差异，引物发生变化的比例为90%。这些产生差异带的多态性引物大体可划分为两大类：一类是在黑麦与普通小麦之间均出现一种或者多种具有差异的产物带，如SCM2、SCM109、SCM180、SCM304，另一类是在黑麦上能扩增但在普通小麦上却未能扩增或者扩增的条带不清晰，如SCM101、SCM120、SCM138、SCM268。[结论]以上这2种情况下的引物均可用于鉴定小麦遗传条件下的黑麦遗传成分。

小麦；单叶片；CTAB 法；SSR-PCR

黑麦在抗病性、抗逆性和产量方面均优于小麦，将控制黑麦优异性状的基因探索出来并导入小麦基因中对小麦育种具有重要意义。张晓祥等[1]采用改良CTAB法、改良SSD法以及沸水浴法进行对比，结果表明，改良的CTAB法提取的DNA纯度和浓度最好，且该方法提取的DNA在凝胶电泳时产生的条带清晰度和亮度较高且一致，DNA完整性较好。李莉等[2]以山东省小麦作为研究材料，采用SSR法对其DNA指纹数据库进行构建，且验证了SSR法比RFLP法和RAPD法产生的基因多样性更多。目前，SSR分子标记技术已广泛应用于小麦品种指纹图谱绘制、种质资源遗传图谱构建、目标性状分子标记筛选及品种纯度检测等领域。迄今为止尚未见利用小麦单片叶片提取DNA并用以检测小麦遗传背景下黑麦遗传成分的相关报道。笔者采用CTAB法提取小麦单片叶片中的DNA，再使用PCR扩增来鉴定哪些微卫星引物可用于鉴定小麦遗传条件下的黑麦遗传成分，旨在利用所筛选的引物鉴定小麦-黑麦代换系5R/5A/与6R/6A杂交的高代材料。

1　材料与方法

1.1材料供试材料为小麦-黑麦代换系5R/5A/与6R/6A杂交的高代材料，品系为14-1，14-2，14-3，14-4，14-5，14-6。

1.2方法

1.2.2SSR-PCR扩增[3]。扩增反应使用的仪器为Thermal Cycler 9600 PCR。PCR程序:95 ℃,6 min，55～60 ℃，30 s，温度以引物而定，72 ℃,1 min, 循环40次，然后在72 ℃下继续扩增 10 min。扩增结束后，于4 ℃下保存备用。

对供试材料进行SSR分析的微卫星引物共20对，由大连宝生物公司合成，这些引物分布在黑麦5R和6R染色体上。引物的退火温度等详细信息见表1[4-5]。

1.2.3扩增产物检测。扩增产物在6%聚丙烯酰胺非变性凝胶上稳压120 V电泳，银染显色，最后照相观察。

1.2.4硝酸银染色步骤[6]。①电泳完成后，将胶块放于摇床上固定液中固定 30 min；②迅速用去离子水冲洗 2～3 次，每次30～40 s；③在摇床上用银染液染色30 min；④重复步骤②，在摇床上放入显影液中显影至第一条清晰可见的泳带出现；⑤最后放入停影液中停影。

2　结果与分析

2.1SSR反应体系探索了DNA质量(RNA含量、DNA长度、DNA浓度)对SSR-PCR扩增的影响，SSR-PCR反应体系对DNA质量影响最小且可使DNA性质保持最为稳定的反应体系(25 μL)：TaqE(5 U/μL)0.2 μL，引物1和引物2(2.5 μmol/L)均为0.7 μL ，DNA (40n g/μL)2.0μl，10×Buffer 2.5 μL，无菌水 16.9 μL。

2.2普通小麦与黑麦之间多态性SSR引物的筛选结果由于筛选的引物主要鉴定小麦-黑麦代换系5R/5A与6R/6A杂交的高代材料，因此，选取20对存在于黑麦R基因组5R、6R染色体上可能提供非同源小片段的SSR引物，所供试的 20对SSR 引物见表1，利用SCM编号的引物和Xgwm编号的引物鉴定小麦遗传背景中的黑麦遗传成分，普通小麦与黑麦的多态性筛选结果见表2。用引物Xgwm 335进行了扩增，结果条带丰富，清晰可辨，效果较好(图1)。

表1　SSR引物详细信息

表2　普通小麦与黑麦多态性 SSR 引物的筛选结果

20对SSR引物中除SCM 28、SCM 306这2种引物未能在普通小麦与黑麦中出现扩增产物，大多数引物均能在黑麦与普通小麦间或者其中一种上出现一条以上的扩增产物。在20对SSR引物中，有 18对在普通小麦与黑麦之间扩增出的产物有差异，引物发生变化的比例为90%。这些产生差异带的多态性引物大体可以归类划分为两大类：一类是在黑麦与普通小麦中均出现一种或多种产物带，此产物带差异的原因是扩增产物的长度不同，如SCM 2、SCM 109、SCM 180 、SCM 304均在普通小麦上产生长度明显差异但表观清晰的条带，此类引物可以利用；还有一种是在黑麦上能扩增但在普通小麦上却未能扩增或扩增的条带不清晰，此类引物也可以利用，如SCM 101、SCM 120、SCM138、SCM 268可以在黑麦上扩增出条带，但在普通小麦ABD染色体组上却未见清晰的条带。这2种情况下的引物均可用于鉴定小麦遗传条件下的黑麦遗传成分。

注：M.Marker；1.普通小麦；2.黑麦。Note: M. Marker 1. Common wheat；2. Rye.图1　引物Xgwm 335 SSR扩增结果Fig. 1 SSR amplification results of primer Xgwm 335

3　结论

位于黑麦基因组的SCM 2、SCM 109、SCM 180、SCM 304、SCM 101、SCM 120、SCM138、SCM 268引物，可用于鉴定小麦遗传条件下的黑麦遗传成分。目前所开发出来的黑麦特异引物还很少，对于鉴定小麦遗传条件下的黑麦遗传成分有一定限制。小麦ABD组染色体上也含有该试验所使用的Xgwm编号引物，且该引物最初是开发定位在小麦微卫星图谱上的，普通小麦和黑麦之间使用Xgwm引物扩增出的产物有差异，这表明理论上也可用于鉴定小麦遗传条件下的黑麦遗传成分。

[1] 张晓祥，王玲,寿路路，等.一种快速提取小麦基因组DNA的改良CTAB方法[J].中国农学通报，2012，28(36)：46-49.

[2] 李莉，王俊峰，颜廷进.基于SSR标记的山东省小麦DNA指纹图谱的构建[J].植物遗传资源学报，2013，14(3)：537-541.

[3] 丁海燕，邢璐璐，张海涛，等. 小麦-黑麦易位系的研究[J].植物研究，2009(1):22-24.

[4] SAAL B，WRICKE G. Development of simple sequence repeat markers in rye (SecalecerealeL.)[J].Genome,1999，42: 964-972.

[5] KHLESTKINA E K,MA HLA MYINT THAN,PESTSOVA E G，et al.Mapping of 99 new microsatellite-derived loci in rye (SecalecerealeL.) including 39 expressed sequence tags[J].Theor Appl Genet, 2004,109:725-732.

[6] 丁海燕，郑茂波，徐英博，等. 一个大穗型小麦-黑麦异代换系的细胞学和SSR鉴定[J].麦类作物学报，2008(2):51-54.

DNA Extraction and SSR-PCR of Single Leaves of Wheat

DING Chen

(College of Biological Engineering, Daqing Normal University, Daqing, Heilongjiang 163712)

[Objective] To find the micro-satellite primers obtained by PCR amplification, which was suitable for the identification of rye genetic component under wheat genetic background. [Method] With wheat single leaf as the test material, DNA was extracted by CTAB method. SSR-PCR amplification was carried out with the obtained DNA as the template. Screening of pleomorphic primer was carried out between common wheat and rye, so as to find the primer of rye genetic component suitable for the identification of wheat genetic background. [Result] From 20 pairs SSR primers, 18 pairs of SSR primers could amplify the different sites between common wheat and rye. The percentage of primer change was 90%. These polymorphic primers could be divided into two types. There were one or more product bands with differences between common wheat and rye, such as SCM2, SCM109, SCM180 and SCM304. The other type could amplify in rye but could not amplify in common wheat or the band was unclear, including SCM 101, SCM120, SCM138 and SCM268. [Conclusion] Under the above two cases, primers can be used to authenticate genetic constitution of rye under common wheat.

Wheat; Single leaf; CTAB; SSR-PCR

黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(201510235036)。

丁晨(1994- ),男,安徽亳州人,本科生,专业:生物技术。

2016-03-30

S 512.1

A

0517-6611(2016)17-175-02