UPLC-MS/MS法检测不同产地野生天麻中天麻素及对羟基苯甲醇含量

秦伟瀚， 师 萱， 花 雷， 白孝勇，张左香，舒兴勇，郭延垒， 阳 勇*

(1.重庆市中药研究院，重庆 400065；2.云南省威信县天麻产业发展办公室，云南威信 657900)



UPLC-MS/MS法检测不同产地野生天麻中天麻素及对羟基苯甲醇含量

秦伟瀚1， 师 萱1， 花 雷1， 白孝勇2，张左香2，舒兴勇2，郭延垒1， 阳 勇1*

(1.重庆市中药研究院，重庆 400065；2.云南省威信县天麻产业发展办公室，云南威信 657900)

[目的]采用超高效液相色谱质谱联用法同时测定6个产地天麻中天麻素和对羟基苯甲醇含量。[方法]采用Phenomenex C18柱(50 mm×2.1 mm，3 μm)，乙腈-5 mmol/L乙酸铵(0.1%甲酸)水溶液作流动相，流速0.2 mL/min；多反应监测正离子模式(MRM-Pos)。[结果]天麻素在0.122 0～1 220.000 0 ng/mL、对羟基苯甲醇在0.502 0～5 020.000 0 ng/ mL浓度范围内呈良好的线性关系。所有样品中天麻素和对羟基苯甲醇的含量均超过《中国药典》2015年版中“天麻”含量测定要求，按照2种成分总含量排序从大到小依次为云南昭通、贵州毕节、四川雅安、重庆城口、陕西汉中、甘肃陇南。[结论]该方法精密度、重现性和分离效果好，分析快速、准确，适用于对天麻中天麻素和对羟基苯甲醇的定性、定量研究。

天麻；超高效液相色谱-质谱/质谱联用；天麻素；对羟基苯甲醇；含量

天麻(Gastrodiaelata Bl.)又名赤箭、独摇芝、离母等，为兰科天麻属多年生草本植物的干燥块茎[1]。早在《神农本草经》中就有关于天麻的记载，称“赤箭”，沈括在《梦溪笔谈》中亦有记载：“世人惑于天麻之说，遂止用之治风，良可惜哉”。至明朝李时珍《本草纲目》始称“天麻”之名[2]。其味甘、性平，入肝经[3]，既是传统名贵中药材，也是深受现代人青睐的保健食材[4]。天麻中富含天麻素、香荚兰素、对羟基苯甲醇、蛋白质、氨基酸、多糖等多种有效活性成分[5]。天麻素是天麻中的主要成分，其含量高低直接影响药材的质量，而对羟基苯甲醇作为天麻素的苷元，在天麻中含量也是颇高。随着天麻主产地野生资源日渐枯竭，其在药市上的售价往往是家种天麻的数倍，对于普通消费者而言不仅价高，且难以辨别，因而野生天麻品质优劣也愈发受到消费者的关注。笔者采集了全国5个主要产区的野生天麻，采用超高效液相色谱串联质谱法同时测定其中主要化学成分的含量，为驯化野生天麻以便于选择更为合适地域提供科学依据，也为天麻产业中质量控制环节提供技术支撑。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1主要仪器。LC-30A型超高效液相色谱仪(日本岛津公司)；API4000型三重四极杆质谱仪(美国AB公司)；高速中药粉碎机(广东新丰机械公司)；BSA224S型万分之一分析天平(德国赛多利斯公司)；RE-52型旋转薄膜蒸发仪(上海亚荣公司)；HH-S8型水浴锅(江苏新宝仪器公司)；KH-55A型烘箱(广东康恒公司)。

1.1.2药材与试剂。收集到6批天麻样品，分别来源于重庆城口、贵州毕节、云南昭通、四川雅安、陕西汉中及甘肃陇南，经重庆市中药研究院刘翔副研究员鉴定为兰科植物天麻GastrodiaelataBl.的鲜品块茎。天麻素(批号110807-200205，中国药品生物制品检定所)，对羟基苯甲醇(批号UMJ5A-SM，东京化成工业株式会社)，乙腈、水(色谱级，德国merck公司)；甲酸、乙酸铵(色谱级，美国ACS公司)，乙醇(分析纯，重庆川东化工公司)。

1.2方法

1.2.1药材预处理。将不同产地鲜品天麻洗净，切成薄片，于蒸锅上蒸制30 min，取出置于烘箱中60 ℃干燥6 h，高速粉碎机粉碎成细末，过3号筛备用。

1.2.2色谱条件。采用菲罗门Luna C18柱(50 mm×2.1 mm，3 μm)色谱柱，柱温30 ℃，进样体积2 μL，流速0.2 mL/min。流动相A为5 mmol/L乙酸铵(0.1%甲酸)水溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序：0～2 min，5%～20% B；2～3 min，20% B；3.0～3.1 min，20%～5%B，3.1～5.0 min，5% B。

1.2.3质谱条件。喷雾电压5 500 V；雾化气压力35 Psi；气帘气压力15 Psi；辅助加热气压力50 Psi；离子源温度400 ℃；多反应监测正离子模式；碰撞气为Medium。定量离子对、定性离子对去簇电压(Declustering potential，DP)、碰撞能量 (Collision energy，CE)见表1。

表1　多反应离子监测参数

注：* 为定量离子对。

Note: * was quantitative ion pairs.

1.2.4对照品储备液的制备。精密称取天麻素及对羟基苯甲醇对照品适量，精密称定，加甲醇配制成每1 mL含天麻素0.122 mg和对羟基苯甲醇0.502 mg的混合对照品溶液，避光，4 ℃环境储存备用。

1.2.5供试品溶液的制备。精密称取样品粉末约2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称定重量，加热回流3 h，放冷，再次称定重量，用稀乙醇补足减失的重量。摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，浓缩至近干。残渣加乙腈-水(5∶95)混合溶液溶解，转移至25 mL量瓶中。用乙腈-水(5∶95)混合溶液稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

1.2.6样品制备。精密称取6个产地的天麻样品各3份，每份2 g，按“1.2.5”方法制备供试品溶液，测定天麻素和对羟基苯甲醇的含量。

2　结果与分析

2.1方法学考察

2.1.1线性范围及检测限。取“1.2.4”项下混合对照品储备液适量，用色谱甲醇逐级稀释为7个不同浓度的系列混合对照品溶液，0.22 μm微孔滤膜滤过，按“1.2.2”色谱条件、“1.2.3”质谱条件分别进样2 μL，进行质谱检测，以天麻素和对羟基苯甲醇峰面积为纵坐标、相应的质量浓度为横坐标，得到天麻素和对羟基苯甲醇的线性回归方程分别为Y=14 654.591 57X+ 7 210.417 17(r=0.999 4)、Y=1 421.507 14X+7 920.872(r=0.999 6)，表明天麻素在0.122 0～1 220.000 0 ng/mL、对羟基苯甲醇在0.502 0～5 020.000 0 ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系。

以基线响应的3倍和10倍作为该物质的检出限和定量限，天麻素、对羟基苯甲醇检出限(LOD)分别为0.006 2、0.015 2 ng/mL，定量限(LOQ)分别为0.024 5、0.054 5 ng/mL。2.1.2稳定性试验。取同一供试品溶液分别在0、4、6、8、12 h进样2 μL测定天麻素、对羟基苯甲醇的峰面积，发现其相对标准偏差(RSD)分别为1.53%、2.04%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.1.3重现性试验。精密称取5份云南昭通的天麻粉末样品，按照“1.2.5”方法进行处理测定天麻素、对羟基苯甲醇峰面积，测得其RSD分别为1.59%、2.34%，表明该方法重现性良好。

2.1.4精密度试验。取同一供试品溶液，按照“1.2.2”色谱条件、“1.2.3”质谱条件重复进样分析5次，测定天麻素、对羟基苯甲醇峰面积，测得其RSD分别为1.68%、1.27%，表明该方法精密度良好。

2.1.5回收率试验。精密称取5份已知含量的云南昭通天麻粉末约1 g，分别精密加入混合标准储备液1 mL，按照“1.2.5”方法进行处理，制备供试品溶液，按照“1.2.2”色谱条件、“1.2.3”质谱条件进样分析，测定峰面积，计算各成分的量及回收率。由表2可知，该方法测定天麻素、对羟基苯甲醇的平均回收率分别为94.45%和92.78%，RSD分别为2.28%和2.41%。由此可见，该方法回收率高、偏差小、准确度高。

表2　回收率试验结果

2.2不同产地天麻中天麻素和对羟基苯甲醇含量分析精密吸取天麻样品溶液2 μL，按照“1.2.2”色谱条件、“1.2.3”质谱条件进样分析，测定峰面积，外标法计算。由表3可见，所有样品中天麻素和对羟基苯甲醇的含量均超过《中国药典》2015年版中“天麻”含量测定要求，说明野生天麻质量比较可靠；云南昭通天麻中天麻素、对羟基苯甲醇及总含量均高于其他样品，而甘肃陇南样品含量则均为最低值；按照2种成分总含量排序从大到小依次为云南昭通、贵州毕节、四川雅安、重庆城口、陕西汉中、甘肃陇南。

表3不同产地天麻中天麻素及对羟基苯甲醇含量

Table 3The contents of gastrodine and 4-hydroxybenzyl alcohol inG.elatain different production area

%

3　结论

该研究采用超高效液相色谱质谱联用法同时测定6个产地天麻中天麻素和对羟基苯甲醇含量，结果表明，天麻素、对羟基苯甲醇含量测定方法的线性关系良好，线性范围分别为0.122 0～1 220.000、0.502 0～5 020.000 ng/mL；所有样品中2种主要成分的含量均超过《中国药典》2015年版中“天麻”含量测定要求，说明野生天麻质量比较可靠；按照2种成分总含量排序从大到小依次为云南昭通、贵州毕节、四川雅安、重庆城口、陕西汉中、甘肃陇南。云南昭通市野生天麻中天麻素及对羟基苯甲醇总含量相对较高(0.94%)，为其作为全国天麻道地产区提供科学依据[6]；四川、贵州的含量与其差异不大，完全可以将这2个产地的天麻作为昭通天麻的替代品。研究中还发现不同纬度天麻素和对羟基苯甲醇含量有差异，而这差异为低纬度含量高于高纬度，这将需要深入研究得到进一步证明。

该研究利用质谱分析的特性，不需要样品峰与杂质峰达到完全分离，样品用量少，且由结果可知天麻素和对羟基苯甲醇的检出限分别为0.006 23和0.015 20 ng/mL，表明该方法灵敏度高，特别适合天麻等传统名贵中药材样品及基质复杂样品的含量测定。该方法精密度、重现性和分离效果好，分析快速、准确，适用于对天麻中天麻素和对羟基苯甲醇的定性、定量研究，为天麻及其相关产品的质量控制提供科学方法。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S]．北京：中国医药科技出版社，2010：54-55．

[2] 孙星衍,孙冯翼.神农本草经[M].北京:人民卫生出版社,1962:22.

[3] 李时珍.本草纲目[M].北京：华文出版社,2009:71.

[4] 谢学强,唐德华,彭宗杰,等.甘孜州野生天麻资源调查[J].安徽农业科学,2015,43(29):27-28.

[5] 杨超,吕紫媛,伍瑞云.天麻的化学成分与药理机制研究进展[J].中国现代医生,2012,50(17):27-31.

[6] 王兴文,方波.昭通野生和栽培天麻中微量元素及氨基酸化学成分研究[J].云南中医学院学报,1994,17(4):1-5.

Determination of Gastrodine and 4-Hydroxybenzyl alcohol inGastrodiaelataBl. from Different Habitats by UPLC-MS/MS

QIN Wei-han, SHI Xuan, HUA Lei, YANG Yong*et al

(Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065)

[Objective] To develop an UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of gastrodine and 4-hydroxybenzyl alcohol inGastrodiaelataBl. from six different habitats. [Method] The analyses were performed on a Phenomenex C18 column (50 mm×2.1 mm, 3 μm) with a mobile phase of acetonitrile -5 mmol/L ammonium acetate aqueous (0.1% formic acid) at a flow rate of 0.2 mL/min operating in MRM positive ion mode (MRM-Pos). [Result] Gastrodine and 4-hydroxybenzyl alcohol contents showed good linearity in ranges of 0.122 0-1 220.000 0 and 0.502 0-5 020.000 0 ng/mL, respectively. In all the samples, gastrodine and 4-hydroxybenzyl alcohol contents all exceeded the content determination requirements in Chinese Pharmacopoeia (2015 edition). These herbs ofGastrodiaelataBl. could be ordered according to the total content of gastrodine and 4-hydroxybenzyl alcohol: Zhaotong in Yunnan > Bijie in Guizhou > Ya’an in Sichuan > Chengkou in Chongqing > Hanzhong in Shanxi > Longnan in Gansu. [Conclusion] This method is quick, precise, rapid and accurate, and is suitable for the qualitative and quantitative research on gastrodine and 4-hydroxybenzyl alcohol inG.elata.

GastrodiaelataBl.; UPLC-MS/MS; Gastrodine; 4-Hydroxybenzyl alcohol; Content

秦伟瀚(1981- )，男，重庆人，助理研究员，从事中药新药开发、药物质量标准研究。*通讯作者，副研究员，硕士，从事中药新药开发、药物质量标准及药物代谢研究。

2016-04-25

S 567.23+9

A

0517-6611(2016)17-143-03