养殖大菱鲆肠炎病的流行病学和病原学研究

姜 燕， 崔晓翠， 张 正， 景亚运， 王印庚，吴立新，常亚青

(1. 大连海洋大学水产与生命学院,辽宁大连 116023；2. 中国水产科学院黄海水产研究所，山东青岛 266071)



养殖大菱鲆肠炎病的流行病学和病原学研究

姜 燕1， 崔晓翠1， 张 正2*， 景亚运1， 王印庚2，吴立新1，常亚青1

(1. 大连海洋大学水产与生命学院,辽宁大连 116023；2. 中国水产科学院黄海水产研究所，山东青岛 266071)

[目的]肠炎病是目前大菱鲆养殖行业中比较常见的疾病之一，该病感染率高，传播迅速。[方法]从山东半岛3个不同的养殖厂肠炎病发病大菱鲆体内分离致病菌，对其进行了常规生理生化特征测试和16SrRNA基因序列对比研究。[结果]从发病大麦鲆体内共分离到了株优势细菌。理化特征分析结果显示这3株菌中有2株分别与溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)表型特征非常相似，另1株细菌被证实为非弧菌属的细菌，具体定种尚需进一步研究。分析这2株弧菌属细菌的16SrRNA基因序列并构建了系统发育树，结果表明这些菌株与溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)的亲缘关系最近。[结论]从发病大菱鲆体内分离菌株的2株细菌被鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)。

大菱鲆；肠炎病；16SrRNA；溶藻弧菌；大菱鲆弧菌

大菱鲆(Scophthalmus maximusL)隶属鲆科菱鲆属，分布于欧洲沿岸各主要海区，是欧洲水产品市场广受欢迎的一种名贵鱼种，具有较高经济价值。我国国内的大菱鲆商业养殖始于1997年。近几年由于养殖规模的不断扩大，疾病的暴发也越来越频繁。每年我国的养殖大菱鲆因疾病的损失就达4亿～5亿元[1]。丁春林等[2]对养殖大菱鲆进行了系统流行病学调查，发现肠炎病是养殖大菱鲆较为常见的疾病之一。笔者从山东半岛不同的养殖厂采集发病大菱鲆的样品，并进行细菌分离和系统病原鉴定研究。

1　材料与方法

1.1病鱼样品的采集从山东半岛3个不同的养殖厂采集到患肠炎病的大菱鲆样品，分别来自莱州市、青岛市流亭镇和荣成市。这3个病鱼样品的肠壁都可见明显充血，且呈红色，肠道中淤积了大量的黄白色粪便和黏液。

1.2菌种的采集分离及培养基无菌挑取病鱼肠道中的白色粪便和黏液接种于盐度3%的TSB(胰蛋白胨大豆肉汤)平板培养基上，28 ℃下培养24～30h后，挑取优势菌的单个菌落纯化2遍后，置于20%甘油中-80 ℃冰箱下保存。

1.3形态观察和生理生化试验使用NikionE800光学显微镜观察细菌个体形态、大小和鞭毛，用半固体培养基穿刺接种培养和水浸片结合观察细菌运动性。参照伯杰氏细菌手册(第9版)对细菌进行常规分类[3]，使用API20E试剂条(法国生物梅里埃公司)结合菌种鉴定管(北京陆桥公司)进行常见碳氮源利用和酶反应的测定，对于一些特征性反应则手工配制相应培养基进行。

1.416SrRNA序列测定与分析

1.4.1PCR模板的制备。将细菌接种在TSB平板上，28 ℃下培养24h。取单一菌落悬浮于无菌去离子水中，100 ℃ 水浴5～10min后，4 ℃下12 000r/min离心10min，上清液即为PCR扩增反应的模板。

1.4.216SrRNA基因序列的PCR扩增和序列测定。16SrRNA基因扩增的正向引物P27f，5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3’，反向引物P1429r，5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’(此引物为细菌16SrRNA基因序列扩增的通用引物)。PCR反应体系(100μL)：1×PCR缓冲液、1.5mmol/LMgCl2、4×dNTP混合物125μmol/mL、引物各7.5nmol/mL、TaqDNA聚合酶1μL(5U/μL)、1μLDNA原液。PCR反应条件如下：94 ℃预变性4min；94 ℃变性30s，55 ℃复性30s，72 ℃延伸100s，35个循环；最后72 ℃温育15min。最后，对PCR产物进行测序。

1.4.3序列分析和系统发育树的构建。将所获得的3株菌的16SrRNA基因序列使用BIOEDIT软件进行对比分析，确定其相似性。从GenBank数据库中选取与他们相似率最高的细菌16SrRNA基因序列，使用BIOEDIT软件中集成的ClustalW软件进行多序列匹配排列，使用系统发生推断软件包PHYLIP3.6a3进行统计和聚类分析。采用邻位相连法(Neighbor-joining)进行发育系统树分析，通过自举分析(Bootstraping)进行系统进化树评估，自举数据集为1 000次[4]。

1.4.4通过系统发育树构建16SrRNA基因序列来源。从GenBank数据库中选取25株与所分析的细菌16SrRNA基因序列相似性较高的已知种菌株，与分离到的菌株共同构建系统发育树。所选取菌株的相关数据和基因编号见表1。

表1　构建系统发育树的16S rRNA基因序列及其数据库编号

2　结果与分析

2.1流行病学特征肠炎病患病鱼病征主要表现为停止摄食或吃食后再吐出，肠道中没有食物，但有大量的黏性柱状白色物质。病情严重者，腹部扁平、下陷，整个内脏团萎缩，肝脏大量出血，体色逐渐变淡(图1)。该病在苗期和养成期均较常见，尤其多见于养成期，亲鱼期很少见到。此病的危害性较大，整池感染率可达90%以上，病鱼表现为慢性死亡，日死亡率均为7%～8%。

图1　大菱鲆肠炎病的外观症状Fig. 1　External appearance of S. maximus with enteritis disease

2.2细菌的形态特征及运动性从这3个病鱼样品中分别分离到1株优势细菌，将其分别编号为菌株Ⅳ、菌株Ⅴ和菌株Ⅵ。这3株菌在盐度3%的TSB下培养基上28 ℃培养24～30h后，其中菌株Ⅳ和菌株Ⅵ形成的单个菌落均很小、透明、接近无色，菌株Ⅴ形成的单个菌落较大、呈弥散性分布。3株细菌的革兰氏染色结果全部呈阴性，短杆状。水浸片显微检查和半固体琼脂穿刺接种培养都未发现这3株菌有明显的运动性。在TCBS琼脂平板培养基上，菌株Ⅳ能生长但菌落不呈黄色，菌株Ⅴ和菌株Ⅵ都呈明显黄色的菌落。

2.3细菌的生长特性这3株菌的温度生长范围存在一定的差异性，菌株Ⅳ在20～35 ℃范围内生长，20 ℃下微弱生长，高于35 ℃几乎不生长。菌株V在10～40 ℃范围内都能生长，并且没有太大的生长速度差异。菌株VI在20～30 ℃范围内生长，低于20 ℃时仍能微弱生长，10 ℃时完全不生长，高于30 ℃时几乎不生长。在盐度3%～5%的范围内这3株细菌生长非常良好；若此盐度范围，这3株细菌表现出一定的生长差异性。在pH高于7的范围内，这3株菌都能良好生长，证明这3株细菌都是嗜碱性的。

2.4生理生化特征 由表2可知，这3株细菌在一些阳性项目上的差异是比较明显的。由于菌株Ⅳ在TCBS琼脂平板培养基上的菌落不显示黄色以及它对O/129抑制剂不敏感，因此初步断定这株细菌不是弧菌属细菌。菌株Ⅴ和菌株Ⅵ在TCBS平板上的菌落都呈明显黄色的菌落，对O/129特征性抑制剂敏感，因此可将菌株Ⅴ和Ⅵ确定为弧菌属细菌。经查阅相关文献，发现菌株Ⅴ在一些指标上与溶藻弧菌(Vibrio alginolytocus)非常相似，初步判断菌株Ⅴ为溶藻弧菌。由于菌株Ⅵ还未查到与其生理生化特征相同或相似的菌株，暂时鉴定为弧菌属细菌。

2.5 16SrRNA基因序列分析和系统发育树的构建将这3株细菌16SrRNA基因序列分别输入GenBank数据库中进行相似性检索，结果发现与菌株Ⅳ相似性最高的前100个序列中50%以上的序列是未鉴定的或非可人工培养的细菌。其中相似率最高的为一种UnculturableMariana eubacterium细菌的16SrRNA序列，相似率为99.79%。与菌株Ⅴ相似性最高的前100个序列中91%为弧菌属细菌，与其最相近的1条16SrRNA序列是溶藻弧菌(V.alginolyticus)的16SrRNA序列，相似率为99.58%。与菌株Ⅵ相似性最高的前100个序列中87%为弧菌属细菌，与其相似率最高的是大菱鲆弧菌(V.scophthalmi)的16SrRNA序列，相似率为99.64%。

从GenBank数据库中选取与菌株Ⅴ和菌株Ⅵ的16SrRNA序列相似性较高的29株细菌的16SrRNA序列进行系统发育学分析，并构建系统发育树。从图2可以看出，B5(菌株Ⅴ)与V.alginolyticus自然聚类成一个分支，B6(菌株Ⅵ)与V.scophthalmi自然聚类成一个分支。B4(菌株Ⅳ)则单独形成一个分支。

综合生理生化特征的试验结果和16SrRNA系统发育学分析的结果，可初步判断从患白便病的大菱鲆肠道中分离的3株优势细菌中2株分别为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)。另1株优势菌由于没有相似率较高的已知种菌株可供比对，暂时还是一种未知细菌。

表2　分离菌株的主要生化特征

注：(+)表示弱阳性生长。

Note: +indicatedweakpositivegrowth.

图2　16S rRNA基因序列的聚类分析结果Fig. 2　Results of 16S ribosomal RNA cluster analysis

3　结论与讨论

肠炎病是养成期大菱鲆的常见疾病，流行范围较广，在黄渤海沿岸的大菱鲆养殖区发生较为普遍。肠炎病虽然是内脏器官的病变，但具有典型的外观发病特征，在生产过程中比较容易发现和识别。针对来源不同的样品，笔者对肠炎病进行病原分离，发现其发病机理比较复杂。笔者从肠道白便中分离到大菱鲆弧菌、溶藻弧菌和1株目前还无法定种的非弧菌属细菌。从病原学的研究结果来看，与白便病发病相关的细菌可能不止1种。

溶藻弧菌是我国近海海水养殖业的常见病原菌之一，可造成多种鱼、虾、贝类的死亡[5-8]。目前在我国关于该菌对养殖大菱鲆的病害研究还属于空白，尽管已经从发病的大菱鲆体内检测到溶藻弧菌，并已证实在大菱鲆肠炎病发病状态下溶藻弧菌是优势菌群之一，但对于该种弧菌确切的入侵方式、准确的致病力以及是原发病原还是继发病原还需要更深入的研究。大菱鲆弧菌是弧菌属中命名种名时间不长的一种细菌。据报道，大菱鲆弧菌是大菱鲆幼苗期肠道中占优势数量的一种细菌，正常情况下并无致病性[9-10]。大菱鲆弧菌在来自不同地理区域的大菱鲆样品肠道中都能被检测出来，在一些育苗场的水体中和活饵体内也曾被检测出来，但在一些池底沉积物中并不常见[11]。在其他的海水养殖鱼类中还没有分离到大菱鲆弧菌的报道，国内的文献也没有关于大菱鲆弧菌致病性的研究报道。据此推断，大菱鲆弧菌可能是大菱鲆引进养殖过程中带入我国的一个新菌种，它是健康大菱鲆肠道中的正常优势菌群，但在大菱鲆患有一些消化道疾病和其他病原菌的入侵下是可能转变为致病菌的，属于继发性病原。然而，关于该菌一些病原学方面的具体特性还需要深入的研究。此外，在大菱鲆的肠道疾病中还分离到1株未知的非弧菌属细菌，通过对其生理生化特征和16SrRNA基因序列的研究，并未在已有文献资料中找到相似性很高的已鉴定菌种，对这株细菌和相关病原学方面将开展更为深入的研究。

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[2] 丁春林,李文全,张健,等.工厂化养殖大菱鲆肠炎病、腹水病防治技术探讨[J].河北渔业,2014(1):46-47.

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EpizooticandAetiologicalStudyontheEnteritisDiseaseinCulturedScophthalmus maximus

JIANGYan1,CUIXiao-cui1,ZHANGZheng2*etal

(1.CollegeofFisheriesandLifeScience,DalianOceanUniversity,Dalian,Shandong116023; 2.YellowSeaFisheriesResearchInstitute,Qingdao,Shandong266071)

[Objective]ToresearchtheepidemiologyandetiologyoftheenteritisdiseaseinculturedScophthalmus maximus. [Method]PathogenicbacteriawereisolatedfromS. maximuswithenteritisdiseaseindifferentaquaticplantsofShandongpeninsula.Thetraditionalphysiologicalandbiochemicaltestsand16SrRNAsequencinganalysiswerecarriedout. [Result]ThreestrainswereisolatedfromthediseasedS. maximus.ResultsofphysicochemicalcharacteristicsshowedthattwostrainswerethesameasVibrio alginolyticusandVibrio scophthalmi,whiletheotherstrainwasidentifiedtobebacteriumnotbelongingtoVibrio,andfurtherresearchwasstillneeded.The16SrRNAsequenceofthetwostrainswasanalyzedandmolecularphylogeneticdendrogramwereconstructed.ResultshowedthattherewashighlevelofconsanguinitybetweenVibrio alginolyticusandVibrio scophthalmi. [Conclusion]ThetwostrainsisolatedfromS. maximusareidentifiedtobeVibrio alginolyticusandVibrio scophthalmi.

Scophthalmus maximus;Enteritisdiseases; 16SrRNA; Vibrio alginolyticus; Vibrio scophthalmi

姜燕(1990- )，女，山东泰安人，硕士研究生，研究方向：水产动物病害防控。*通讯作者，副研究员，博士，硕士生导师，从事水产动物病原学研究。

2016-05-10

S941

A

0517-6611(2016)17-123-04