蒲公英绿原酸的酶法提取及其在卷烟中的应用

倪 悦，徐 达，孙 强，邓 宇，田耀伟，陈若星

(江西中烟工业有限责任公司技术研发中心，江西南昌 330096)



蒲公英绿原酸的酶法提取及其在卷烟中的应用

倪 悦，徐 达，孙 强，邓 宇，田耀伟*，陈若星

(江西中烟工业有限责任公司技术研发中心，江西南昌 330096)

[目的] 研究不同提取方法对蒲公英绿原酸提取效率的影响并完成工艺优化，通过加料评吸试验为蒲公英绿原酸在卷烟中的应用提供参考。[方法]采用3种提取方法对蒲公英绿原酸进行提取，针对酶解醇提法进行工艺优化，考察酶液添加量、料液比、酶解温度、酶解时间对绿原酸提取效率的影响，并通过正交试验确定最优工艺条件。[结果]最优工艺条件为：酶液添加量为3mL，料液比为1∶12g/mL，酶解温度为45 ℃，酶解时间为3h。按照上述最优工艺条件制备得到的蒲公英提取物中，绿原酸提取率可达5.33mg/g。将该提取物产品按照0.1%加料进行卷烟应用研究，结果显示：卷烟的甜润感、刺激性、余味、干燥感均有较为明显的提升，同时在烟香和香气浓度上损失也较小，总体较为均衡。[结论]酶解醇提法在蒲公英绿原酸提取中具有较高的效率，该提取物应用于卷烟中能显著提高烟气的感官舒适性，在烟用香料领域有一定的应用前景。

蒲公英；绿原酸；酶解；工艺优化

蒲公英，别名黄花地丁、黄花三七、婆婆丁等，原产于欧洲，临床常用中药，有清热解毒、消肿散结、利尿通淋之功效。蒲公英提取物中含有大量的多糖类、有机酸类等多种活性成分，其中的绿原酸是一种多酚类物质，具有重要的生理活性。试验证明，蒲公英中的有机酸(以绿原酸为主)可以明显降低烟气刺激性，提高香气质量，故而蒲公英提取物常被用作烟用香料应用于卷烟中。

目前，国内针对蒲公英的提取研究较多，但提取手段十分单一，主要是水提、醇提法[1]。近年来，有研究者采用纤维素酶对蒲公英进行了初步的探索，但未对酶解法提取优势进行阐述，缺乏各种工艺方法间的提取效率对比。鉴于此，笔者通过3种提取工艺对比筛选后，采用复合植物水解酶ViscozymeL先对蒲公英的细胞壁物质进行预处理，提高其中绿原酸等有机酸的溶出率，然后采用50%的醇水体系对蒲公英绿原酸进行提取，最后针对该提取物进行了卷烟加料应用研究。目前，绿原酸提取的原料主要是金银花、杜仲叶、甘薯、杭白菊、牛蒡叶等[2-3]，该研究为这类天然本草提取物在卷烟中的应用提供了技术依据。

1　材料与方法

1.1材料蒲公英，江西汇仁药业有限公司，粉碎过40 目筛；复合植物水解酶ViscozymeL(酶活≥100FBG/g，FBG为真菌β-葡聚糖酶单位)，诺维信公司，使用前配成 1g/L酶溶液；绿原酸标准品(纯度>98%)，北京中科三捷生物有限公司；壳聚糖、无水乙醇，均为分析纯。

主要仪器设备：MRHei-standard磁力加热搅拌器，德国Heidolph公司；LX-300冷却水循环机，北京长流科学仪器公司；CP2245电子天平，德国Sartorius公司；Lambda750紫外分光光度计，美国PE公司；HW·YS型数显恒温水浴锅，浙江舟山市定海区海源仪器厂。

1.2蒲公英绿原酸的提取

1.2.13种提取工艺。工艺A(酶解醇提法)：准确称取1g蒲公英干粉置于50mL的圆底烧瓶中，按照1∶10g/mL的料液比用10g去离子水作为溶剂，加入2mL酶液进行酶解，控制酶解温度45 ℃，酶解时间为2h。完成后，加入10g乙醇(50%醇水体系)进行水浴回流2h，之后加入3mL10g/L壳聚糖溶液，静置2h，抽滤、浓缩至10g即得。

工艺B(酶解水提法)：准确称取1g蒲公英干粉置于50mL的圆底烧瓶中，首先采用10g去离子水作为溶剂，加入2mL酶液进行酶解，pH保持自然状态，45 ℃水浴2h。完成后，提高温度至100 ℃进行水浴回流2h，之后加入3mL10g/L壳聚糖溶液，静置2h，抽滤、浓缩至10g即得[4]。

工艺C(醇提法)：准确称取1g蒲公英干粉置于50mL的圆底烧瓶中，采用50%乙醇溶液20g作为提取溶剂，摇匀，密封置于水浴锅中水浴(80 ℃)回流2h，加入3mL10g/L壳聚糖溶液，静置2h，抽滤、浓缩至10g即得[5-6]。

1.2.2影响蒲公英绿原酸提取效率的单因素试验。

1.2.2.1酶液添加量。按照“1.2.1”的工艺A试验方法，控制液料比为1∶10g/mL，酶解温度为45 ℃，酶解时间为2h，考察酶液添加量(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mL)对蒲公英绿原酸提取效率的影响。

1.2.2.2料液比。根据“1.2.2.1”的试验结果选择最优的酶液添加量，控制酶解温度为45 ℃，酶解时间为2h，考察料液比(1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15g/mL)对蒲公英绿原酸提取效率的影响。

1.2.2.3酶解温度。根据“1.2.2.1”和“1.2.2.2”的试验结果选择最优的酶液添加量、料液比，控制酶解时间为2h，考察酶解温度(25、35、45、55、65 ℃)对蒲公英绿原酸提取效率的影响。

1.2.2.4酶解时间。根据“1.2.2.1、1.2.2.2、1.2.2.3”的试验结果，选择最优的酶液添加量、料液比、酶解温度，考察酶解时间(分别为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0h)对蒲公英绿原酸提取效率的影响。

1.2.3蒲公英绿原酸提取工艺的正交优化试验。根据单因素的试验结果，按照表1设计安排正交试验L9(34)，考察4个因素对蒲公英绿原酸提取效率的综合影响[7]。

表1蒲公英绿原酸提取效率的正交试验因素水平

Table1Factorsandlevelsoforthogonaltestontheextractionrateofchlorogenicacidfromdandelion

水平Level因素Factor酶液添加量Enzymedosage(A)∥mL料液比Solid-liquidratio(B)g/mL酶解温度Enzymolysistemperature(C)∥℃酶解时间Enzymolysistime(D)∥h111∶10351221∶12452331∶15553

1.3测定项目及方法

1.3.1绿原酸提取率测定。将提取物产品置于50mL容量瓶中定容，取200μL样品溶液于10mL容量瓶中，放在60 ℃干燥箱中烘干，并用50%乙醇溶液(体积分数)定容，于波长327nm处测定吸光度，得到绿原酸的提取率。

绿原酸提取率=提取液中绿原酸质量(mg)/蒲公英干粉质量(g)

1.3.2蒲公英提取物在卷烟中的应用结果。采用金圣(软红)空白叶组，将3种不同制备工艺得到的蒲公英提取物添加到金圣(软红)叶组中，添加量为0.1%(以烟丝重量为基准)，参考中式卷烟风格感官评价方法[8-9]，组织5位评烟委员进行感官评吸，筛选出最优的制备方法。另外，采用香味轮廓法[10]针对工艺优化后的蒲公英提取物进行评吸，探索该蒲公英绿原酸在卷烟中的应用效果。

2　结果与分析

2.1绿原酸浓度标准曲线的建立采用50%的乙醇溶液(体积分数)配制42.5μg/mL绿原酸标准溶液。取适量绿原酸标准溶液，置于分光光度计中于波长200～500nm范围内进行扫描，以体积分数为50%的乙醇溶液作参比，结果表明，在波长327nm处有最大吸收峰[11]。

标准曲线的绘制：精密吸取以上绿原酸标准溶液0、1、2、3、4、5mL，分别置于6个 10mL容量瓶中，加体积分数为50%的乙醇溶液定容，摇匀。在波长327nm处分别测定不同浓度标准溶液的吸光度，以绿原酸标准样品浓度(μg/mL)为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。绿原酸浓度标准曲线见图1，回归方程为y=0.048 5x+0.098 6，相关系数R2=0.999 2，结果表明，在0～0.223 3μg/mL的浓度范围内有较好的线性关系。

图1　绿原酸浓度标准曲线Fig.1　Standard curve of chlorogenic acid concentration

2.23种提取工艺的提取效率比较3种提取工艺的提取效率见图2，工艺A(酶解醇提法)的绿原酸提取率为3.85mg/g，显著优于工艺B(0.84mg/g)和工艺C(2.38mg/g)。绿原酸易溶于乙醇，在水中的溶解度很小，所以工艺A、工艺C优于工艺B。另外，工艺A中，采用复合纤维素酶可以有效地针对蒲公英细胞壁物质进行水解，显著促进提取效率，生成的还原糖类等小分子物质则对卷烟提质有积极的促进作用。

图2　3种蒲公英绿原酸的提取工艺比较Fig.2　Comparison of three extraction technologies of chlorogenic acid

将3种不同制备工艺得到的蒲公英提取物添加到金圣(软红)叶组中，添加量为0.1%(以烟丝重量为基准)，不经加香直接手工卷制，平衡水分，参考行业标准进行感官评吸。由表2可知，4款卷烟评吸结果为：工艺A>工艺C>工艺B>空白；对比空白卷烟，添加了蒲公英提取物的卷烟在香气质量以及木质杂气方面有了整体的提高；工艺A制备得到的样品整体得分最高，木质气息和刺激性明显减轻，润感明显，香气质有提高，协调性相对较好，余味舒适。故接下来采用工艺A针对蒲公英进行酶解醇提法工艺优化试验。

表2　3种蒲公英提取物的评吸结果比较

2.3蒲公英绿原酸的酶解醇提法工艺优化蒲公英的酶解醇提工艺优化首先针对酶液添加量、液料比、酶解温度、酶解时间进行单因素优化，然后根据单因素优化结论进行正交试验。

2.3.1酶液添加量对绿原酸提取率的影响。由图3可知，绿原酸提取率随着酶液添加量的增加而提高，在添加量为2mL后则提取率增加不明显。考虑到经济性，确定2mL为最佳酶液添加量。

图3　酶液添加量对绿原酸提取率的影响Fig.3　Effects of enzyme dosage on the extraction rate of chlorogenic acid

2.3.2料液比对绿原酸提取率的影响。由图4可知，绿原酸提取率随着液料比中溶剂用量的增加而提高，在料液比1∶12g/mL后提取率增加不明显。考虑到经济性，确定1∶12g/mL为最佳料液比。

图4　料液比对绿原酸提取率的影响Fig.4　Effects of solid-liquid ratio on the extraction rate of chlorogenic acid

2.3.3提取温度对绿原酸提取率的影响。由图5可知，绿原酸提取率随着提取温度的升高先增加后降低，在温度为45 ℃时提取率达到最高，继续提高温度则提取率降低。这可能是由于温度过高，复合酶活性降低导致。

图5　提取温度对绿原酸提取率的影响Fig.5　Effects of enzymolysis temperature on the extraction rate of chlorogenic acid

2.3.4提取时间对绿原酸提取率的影响。由图6可知，绿原酸提取率随着提取时间的增加而增加，在时间为2h时提取率达到较高水平，继续增加提取时间则提取率增加不明显。故选择2h为最优的酶解时间。

图6　提取时间对绿原酸提取率的影响Fig.6　Effects of enzymolysis time on the extraction rate of chlorogenic acid

2.3.5蒲公英绿原酸的酶解醇提法工艺的正交试验。由表3可知，以蒲公英绿原酸的提取率为评价标准，影响提取率酶解醇提工艺的因素大小依次为酶解温度、酶解时间、酶液添加量、料液比。最佳工艺条件为A3B2C2D3，即酶液添加量为3mL、料液比为1∶12g/mL、酶解温度为45 ℃、酶解时间为3h。经检测，按照上述工艺条件制备得到蒲公英提取物中绿原酸提取率为5.33mg/g。

2.4含绿原酸的蒲公英提取物在卷烟中的应用采用香味轮廓分析法进行5人次评吸，结果如图7和8所示，可以看到，随着蒲公英提取物添加量的提高，卷烟的清香和甜香有了较为明显的增强，并且在刺激性、干燥感和香气的细腻感上有了较为明显的增强[12]。在三类卷烟金圣(软红)空白叶组中添加量为0.1%时，卷烟的甜润感、刺激性、余味、干燥感均有较为明显的提升，同时在烟香和香气浓度上损失也较小，总体较为均衡，为该蒲公英提取物在此款卷烟中较为合适的添加比例。

表3蒲公英绿原酸的酶解醇提法工艺的正交试验结果

Table3Orthogonaltestresultsofenzymatichydrolysisandalcoholextractionmethodofchlorogenicacidfromdandelion

试验号TestNo.因素FactorABCD绿原酸提取率Extractionrateofchlorogenicacid∥mg/g111112.55212224.62313334.01421235.04522313.87623124.23731324.33832134.56933214.67k13.733.973.783.70k24.384.354.784.39k34.524.304.074.54R0.790.381.000.84

3　结论与讨论

通过对蒲公英绿原酸3种提取工艺的筛选，采用酶解醇提法具有较高的提取效率，并通过正交试验确定了最优工艺条件：酶液添加量为3mL，料液比为1∶12g/mL，酶解温度为45 ℃，酶解时间为3h，按照上述最优工艺条件制备得到的蒲公英提取物中绿原酸提取率可达5.33mg/g。该提取物按照0.1%加料添加在卷烟中，卷烟的甜润感、刺激性、余味、干燥感均有较为明显的提升，同时在烟香和香气浓度上损失也较小，总体较为均衡。

图7　中式卷烟风格感官评价结果(未添加蒲公英提取物)Fig.7　Sensory evaluaion results of Chinese style cigarette(not adding dandelion extracts)

图8　中式卷烟风格感官评价结果(添加0.1%蒲公英提取物)Fig.8　Sensory evaluaion results of Chinese style cigarette(adding 0.1% dandelion extracts)

该研究将酶技术应用在了蒲公英绿原酸的提取中，相对于绿原酸提取领域单一的方式方法有一定的借鉴意义。目前，多项研究表明，绿原酸对卷烟抽吸品质有积极的提升效

果，该研究提取得到的蒲公英绿原酸将在卷烟香料领域中具有广泛的应用前景。

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EnzymaticExtractionofChlorogenicAcidfromDandelionandItsApplicationinCigarette

NIYue,XUDa,SUNQiang,TIANYao-wei*etal

(TechnologyResearchCenter,ChinaTobaccoJiangxiIndustrialCorporation,Nanchang,Jiangxi330096)

[Objective]Toresearchtheeffectsofextractionmethodsontheextractionrateofchlorogenicacidfromdandelion,tooptimizethetechnology,andtoprovidereferencesfortheapplicationofchlorogenicacidincigarettebysmokepaneltest. [Method]Chlorogenicacidwasextractedfromdandelionbythreemethods.Technologyoptimizationofenzymatichydrolysisandalcoholextractionmethodwascarriedout.Effectsofenzymedosage,solid-liquidratio,enzymolysistemperatureandenzymolysistimeontheextractionrateofchlorogenicacidwereresearched.Theoptimaltechnologyconditionwasconfirmedbyorthogonaltest. [Conclusion]Theoptimaltechnologyconditionwasasfollows: 3mLenzymedosage, 1∶12g/mLsolid-liquidratio, 45 ℃enzymolysistemperature,and3henzymolysistime.Underthiscondition,theextractionrateofchlorogenicacidindandelionextractswas5.33mg/g.Theextractswereusedforcigaretteaccordingtothepercentageof0.1%.Resultsshowedthatthesweet,irritation,aftertaste,drynessofcigarettewereimprovedobviously,withlowerlossoftobaccoaromaandaromaconcentration. [Conclusion]Enzymatichydrolysisandalcoholextractionmethodhasrelativelyhighefficiencyintheextractionofchlorogenicacidfromdandelion.Applyingtheextractsincigarettesignificantlyenhancesthesensorycomfortlessof,whichisofcertainapplicationprospectinthefieldoftobaccoflavors.

Dandelion;Chlorogenicacid;Enzymaticextraction;Technologyoptimization

江西中烟工业有限责任公司科技项目(赣烟工科计2014-05)。

倪悦(1985-)，男，江苏苏州人，助理工程师，硕士，从事卷烟产品研发。*通讯作者，工程师，硕士，从事卷烟香精香料开发与应用研究。

2016-05-03

TQ914.1

A

0517-6611(2016)17-107-04