不同龄期果蝇DNA含量的检测与比较

黄莉娜，王剑峰，高 成，刘广纯

(沈阳大学，辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室，辽宁沈阳 110044)



不同龄期果蝇DNA含量的检测与比较

黄莉娜，王剑峰，高 成，刘广纯*

(沈阳大学，辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室，辽宁沈阳 110044)

[目的]测定8种果蝇不同龄期的DNA含量。[方法]从黑果蝇(Drosophilavirilis)和黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)的7个突变品系的幼虫Ⅰ龄、Ⅱ龄、Ⅲ龄、蛹、成虫提取总DNA。使用紫外可见分光光度计对提取的DNA含量进行测定，并对提取的DNA进行了PCR效果检测。[结果]8种果蝇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ龄幼虫DNA含量递增，大部分蛹和成虫DNA含量递减；果蝇5个龄期提取DNA的PCR效果均很好，成虫最佳，幼虫次之。[结论]幼虫、蛹和成虫的DNA质量均可保证PCR扩增、分子克隆、物种鉴定等实验的开展。

果蝇；龄期；DNA含量；PCR

脱氧核糖核酸(DNA)是大多数生物的遗传物质，它们的载体是染色体或染色质。为了维持世代间的平衡，大多数生物的体细胞中所含的染色体和形态都是恒定的。因此，细胞中所含DNA的量也是基本恒定的，DNA含量可作为一个物种种质的特征性参数[1]。DNA含量的测定作为限制性与非限制性酶切反应、PCR扩增、分子克隆、物种鉴定等分子研究的起点，可以判断生物体生理病理的变化，同时对基因表达、致病基因检测和药效评价具有重要的价值[2]。

在昆虫学研究领域，基于DNA可以开展DNA条形码研究，用于解决法医昆虫鉴定、外来入侵害虫快速识别等难题[3]。法医昆虫的鉴定，通过尸体上繁殖的蛆虫可以用于判断是否移尸并估计死亡时间[4]。入境检验检疫部门截获的昆虫大多数为卵和幼虫。幼虫的特征形态差异小，在不同的发育时期有些特征不够稳定，因此依靠形态学进行物种鉴定不够准确[5]。Elderkin等[6]利用DNA条形码成功鉴定了Hexagenialimbata和Hexageniarigida2种蜉蝣幼虫。岳巧云等[5]通过COⅠ基因对形态无法区分的鞘翅目幼虫进行了鉴定，证实了DNA条形码在幼虫鉴定方面的实用性和准确性。但是，不同龄期幼虫、蛹及成虫的DNA含量不尽相同，在进行DNA鉴定时效果并不一致，是否可以有效提取DNA以及提取的DNA的含量和质量将会直接影响PCR效果，进而对物种的鉴定产生影响。

果蝇具有生活周期短、容易饲养、繁殖力强、染色体数目少且易于观察等特点，因而是遗传学研究的最佳材料[7]。作为经典的模式生物，果蝇被广泛应用到各种研究中。笔者选用8个品系果蝇作为试验材料，通过对8个品系果蝇的5个龄期的DNA含量进行检测与分析，分析不同品系果蝇DNA含量的差异以及同一品系果蝇5个龄期DNA含量的变化，同时进行PCR效果检测。

1　材料与方法

1.1试验材料选取黑果蝇[Drosophilavirilis(D)]和黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)的7个突变品系的5个龄期(Ⅰ龄、Ⅱ龄、Ⅲ龄、蛹、成虫)作为试验材料，7个突变品系具体见表1。均由辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室长期饲养。

1.2DNA提取总DNA的提取采用破碎的方法，1个样品中包含5头果蝇。将浸泡于无水乙醇中的果蝇取出，用1×TE(Tris，EDTA)缓冲液洗涤2次，使用TIANGEN TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒按照说明书进行总DNA的提取，溶于100 μL buffer TE，并于-20 ℃下保存。

1.3DNA含量的测定使用UV-3200PCS紫外分光光度计进行DNA含量的测定。

1.4PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳 使用Agilent Sure Cycle 8800梯度PCR仪对提取DNA进行PCR扩增，采用通用引物[8]：LCO1490(5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)和HCO2198(5’-TAAACTTCAGGGTGACC-AAAAA-ATC-3’)。PCF反应体系(30 μL)：ddH2O 21.25 μL、10×Buffer 3.0 μL、dNTP 2.4 μL、上下游引物各0.6 μL、Taq酶5 U/μL(0.15 μL)、DNA模版2 μL。PCR扩增反应条件如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 20 s，41个循环；72 ℃延伸10 min。

取2 μL PCR扩增产物与6×loading buffer混合均匀，采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增效果。使用DYY-6B稳压稳流电泳仪和DYCP-31A琼脂糖电泳槽进行电泳，电泳完成后使用BIO-RAD凝胶电泳成像系统进行观察和拍照。

表1　黑腹果蝇的7个品系

2　结果与分析

2.1各品系果蝇5个龄期DNA含量的比较由表2可知，8种果蝇DNA含量为0.61～7.08 μg/头，8种果蝇幼虫的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ龄的DNA含量呈现递增的趋势，蛹和成虫的DNA含量则呈下降趋势。 其中，黑果蝇DNA含量为0.92～3.98 μg/头，蛹期最少(0.92 μg/头)，Ⅲ龄幼虫的DNA含量最高(3.98 μg/头)。野生型黑腹果蝇的DNA含量为0.08～1.10 μg/头，其中成虫的DNA含量最高，为1.10 μg/头。短刚毛型的DNA含量为1.46～4.02 μg/头，其中Ⅰ龄期与成虫相同，Ⅲ龄期最高(4.02 μg/头)。匙状翅型黑腹果蝇的DNA含量为0.80～2.72 μg/头，其中Ⅲ龄期最高(2.72 μg/头)。白眼型果腹果蝇的DNA含量为0.79～1.33 μg/头，其中含量最高的是Ⅲ龄期为1.33 μg/头。新三隐型黑腹果蝇的DNA含量为0.61～1.50 μg/头，其中蛹的含量最高(1.50 μg/头)。白眼黄身型黑腹果蝇的DNA含量为0.89～1.83 μg/头，其中Ⅲ龄DNA含量最高(1.83 μg/头)，成虫的DNA含量最低(0.89 μg/头)。残翅型黑腹果蝇的DNA含量为1.00～7.08 μg/头，其中蛹的DNA含量最高(7.08 μg/头)，成虫的含量最低(1.00 μg/头)。

表2　8种果蝇5个龄期DNA含量的比较

2.28种果蝇5个龄期DNA含量的比较由表2可知，幼虫Ⅰ龄时DNA含量从小到大依次为黑腹果蝇的新三隐型、白眼型、野生型、匙状翅型、白眼黄身型、短刚毛型、残翅型、黑果蝇。幼虫Ⅱ龄时DNA含量从小到大依次黑腹果蝇的野生型、白眼型、新三隐型、白眼黄身型、匙状翅型、短刚毛型、残翅型、黑果蝇。Ⅲ龄幼虫的DNA含量从小到大依次为黑腹果蝇野生型、新三隐型、白眼型、白眼黄身型、匙状翅型，黑果蝇，黑腹果蝇短刚毛型、残翅型。蛹的DNA含量从小到大依次为黑腹果蝇匙状翅型、野生型、黑果蝇、黑腹果蝇白眼型、新三隐型、白眼黄身型、短刚毛型、残翅型。成虫DNA含量从小到大依次为黑腹果蝇白眼黄身型、残翅型、新三隐型、匙状翅型、野生型、白眼型、短刚毛型、黑果蝇。

2.38种果蝇提取DNA的PCR效果检测从图1可以看出，黑果蝇和黑腹果蝇的7个突变型品系的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ龄幼虫、蛹

注：a.Ⅰ龄幼虫；b.Ⅱ龄幼虫；c.Ⅲ龄幼虫；d.蛹期；e.成虫。Note：a.Ⅰ instar larva；b.Ⅱ instar larva；c.Ⅲ instar larva；d.Pupa；e.Imago.图1　不同龄期8种果蝇提取DNA的PCR产物的琼脂糖电泳图谱Fig.1　Agarose gel electrophoresis of the PCR product of DNA extracted from 8 species of fruit flies at different ages

和成虫都获得了清晰的条带，PCR扩增效果均较好，其中成虫的PCR扩增效果最好。DL2000中500 bp条带最亮，每次用量约为34 ng，其他条带的DNA用量均为17 ng。5头样品共有100 μL，平均每头样品为20 μL，样品每次上样2 μL。8种果蝇每头Ⅰ龄幼虫的COI含量均大于340 ng，Ⅱ龄幼虫中黑果蝇、黑腹果蝇短刚毛型、白眼型、白眼黄身型和残翅型的COI含量均大于340 ng，新三隐型和匙状翅型的COI含量均为170～340 ng，野生型COI含量则低于170 ng，Ⅲ龄幼虫黑腹果蝇残翅型的COI含量低于170 ng，其余7种的COI含量均高于340 ng，蛹期和成虫的COI含量均大于340 ng。

3　结论

该试验结果表明8种果蝇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ龄幼虫DNA含量递增，幼虫的Ⅲ龄个体最大，大部分蛹和成虫DNA含量递减。成虫的DNA含量并不是果蝇DNA含量的最高时期。黑果蝇的DNA 含量明显高于其他品系。除黑果蝇以外，Ⅲ龄幼虫的DNA含量往往是5个龄期最高的，DNA含量最低的时期最多出现在Ⅰ龄幼虫或成虫。果蝇5个龄期DNA的PCR扩增效果都很好，其中成虫的PCR扩增效果最好，幼虫次之。幼虫、蛹和成虫都可作为分子鉴定的材料，为物种鉴定提供帮助。

[1] 范兆廷，尹洪滨，宋苏祥.十三种淡水养殖鱼类的DNA含量[J].水产学报，1995，19(4)：322-326.

[2] 戴二黑.病毒核酸定量测定方法及其存在问题[J].国外医学(病毒学分册)，2002，9(1)：12-24.

[3] 岳巧云，冯文军，王章根，等.DNA条形码技术在鉴定蛆症异蚤蝇中的应用[J].中国卫生检验杂志，2010，20(6)：1400-1402.

[4] 王浜琴，蔡继峰，葛燕，等.尸源性昆虫的法医学研究进展[J].法医学杂志，2008，24(3)：210-213.

[5] 岳巧云，邱德义，黄义文，等.DNA条形码技术在未知昆虫幼虫种类鉴定中的应用[J].中国卫生检验杂志，2011，21(3)：615-617.

[6] ELDERKIN C L，CORKUM L D，BUSTOS C.DNA barcoding to confirm morphological traits and determine relative abundance of burrowing mayfly species in western Lake Erie[J].Journal of great lakes research，2012，38(1)：180-186.

[7] 李廷利，许光辉，徐瑞鑫.影响野生型Canton S 果蝇睡眠神时间的相关生理因素[J].中国实验动物学报，2010，18(2)：105-108.

[8] FOLMER O，BLACK M，HOEH W，et al.DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome coxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates[J].Molcular Mar Biol Biotechnol，1994，3(5)：294-299.

Detection and Comparison of DNA Content in Fruit Flies in Different Periods

HUANG Li-na, WANG Jian-feng, GAO Cheng, LIU Guang-chun*

(Liaoning Key Laboratory of Urban Integrated Pest Management and Ecological Security, Shenyang University, Shenyang, Liaoning 110044)

[Objective] The aim was to determine DNA content in 8 fruit flies at different ages. [Method] Total DNA was extracted from Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ instar larva, pupa, imago of 7 mutant lines ofDrosophilavirilisandDrosophilamelanogaster. DNA content was determined by ultraviolet visible spectrophotometer, PCR detection was conducted on DNA. [Result] The contents of DNA in eight fruit flies I, II and III instar larva were increased, and the contents of DNA in most of the pupa and imago were decreased; the efficiency of PCR of fruit flies in five periods were all good, imago was the best, larva was better. [Conclusion] The DNA quality of larva, pupa and imago all can ensure the experiments carry out such as the PCR amplification, molecular cloning, species identification and so on.

Fruit flies; Age; DNA content; PCR

国家自然科学基金项目(31201743，31372245)；辽宁省教育厅科学研究项目(12013452)。

黄莉娜(1991- )，女，内蒙古包头人，硕士研究生，研究方向：昆虫系统学和分子生物学。*通讯作者，教授，博士，博士生导师，从事昆虫系统分类和害虫防治研究。

2016-04-23

S 186

A

0517-6611(2016)17-007-02