蜈蚣草甲醇提取物的抗氧化活性研究

侯文成，韩丹丹，陈曼丽，骆焱平

（海南大学环境与植物保护学院，海南 海口 570228）



蜈蚣草甲醇提取物的抗氧化活性研究

侯文成，韩丹丹，陈曼丽，骆焱平*

（海南大学环境与植物保护学院，海南 海口 570228）

以蜈蚣草为试材，甲醇为溶剂，采用渗漉法浸提蜈蚣草，结合GC-MS对蜈蚣草甲醇提取物成分进行检测，并对蜈蚣草提取物的抗氧化性进行研究。结果表明：蜈蚣草甲醇提取物中酯类成分最多，占54.22%；其次为醇类物质，占24.03%；酮类、酸类和吲哚类物质含量较少，依次为10.44%、6.73%和1.34%；总黄酮含量为4.81%；蜈蚣草提取物对DPPH自由基的清除率最强，半数效应浓度（EC50）为0.15 mg/mL，脂质过氧化抑制作用、超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢清除作用的EC50分别为6.55、0.09、4.11、0.45 mg/mL。

蜈蚣草；甲醇提取物；总黄酮；抗氧化活性

投稿网址：http：//xb.ijournal.cn

蜈蚣草（Pteris vittata L.）是凤尾蕨科（Pteridaceae）的多年生草本植物，别名舒筋草、蜈蚣蕨、长叶甘草蕨、牛肋巴［1］，生长在山坡、路边的钙质土或石灰岩壁缝中，可作为钙质土和石灰岩的指示植物［2］，广泛分布于长江以南的广大地区［3］。

蜈蚣草可入药，有祛风除湿、杀虫、治疳疮、止血、止泻等功效［4］。周向军等［5］通过加热回流法提取蜈蚣草黄酮类化合物，分析了它对羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除作用，发现其具有较好的抗氧化活性；孙俊等［6］利用纤维素酶-微波联合提取蜈蚣草黄酮，并测试其抗氧化活性，发现该提取物有良好的抗氧化活性；丁利君等［7］利用微波辅助提取蜈蚣草总黄酮，研究其抗氧化活性，发现蜈蚣草总黄酮含量高，抗氧化活性好。笔者采用渗漉法［8］提取蜈蚣草粗提物，利用GC-MS技术分析了粗提物的化学成分，并测试了蜈蚣草甲醇提取物的还原能力、脂质过氧化抑制作用、DPPH自由基清除作用、超氧阴离子清除作用、羟基自由基和过氧化氢清除作用，现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1材料

蜈蚣草（Pteris vittata L.），采自海南大学儋州校区附近的沟渠边，经本校植物学专家鉴定确认。

芦丁（C27H30O16）、水溶性维生素E（Trolox）、亚油酸（C18H32O2）、吐温-20（C58H114O26）、硫氰酸铵（NH4SCN）、1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、N-甲基吩嗪甲基硫酸盐（PMS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、D-2-脱氧核糖（C4H9O3CHO）、过氧化氢酶（CAT）、硫代巴比妥酸（TBA）、辣根过氧化物酶（HRP）等均为市售，分析纯或化学纯。

1.2方法

1.2.1蜈蚣草甲醇提取物的制备

蜈蚣草全株30 g，洗净，室温晾干，粉碎，过0.380 mm孔径的筛，置于500 mL玻璃瓶中，加入工业甲醇，使甲醇刚好没过蜈蚣草粉末。采用渗漉法提取3次，每次3 d。过滤，合并滤液，40 ℃减压浓缩，真空干燥至恒重，得蜈蚣草提取物，备用。

1.2.2蜈蚣草甲醇提取物的GC-MS分析

用安捷伦7890B-7000B GC-MS技术对蜈蚣草甲醇提取物进行成分分析。气相色谱条件：安捷伦HP-5ms（30 m×0.25 mm，0.25 μm）色谱柱，程序升温为60 ℃保留2 min，6 /min℃升至300 ℃，保留10 min；载气为高纯He；进样口温度250 ℃，传输线温度250 ℃。质谱条件：EI源；电离电压70 eV；离子源温度250 ℃；扫描质量数范围20～450 （m/z）；进样量1.0 μL。

1.2.3蜈蚣草甲醇提取物总黄酮含量的测定

称量芦丁10 mg，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解，定容得到芦丁标准溶液。

标准曲线的制备：量取芦丁标准溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，不足8mL的用50%甲醇补足；加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min；再加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min；加入1 mol/L 氢氧化钠溶液10 mL，最后加50%甲醇定容，摇匀，放置10 min。以50%甲醇代替样品作为空白对照，在500 nm 波长处测定吸光度，以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

总黄酮含量测定：称取样品3.2 mg，溶于5 mL 50%甲醇中，得到供试样品溶液；取供试样品溶液2.5 mL，置于25 mL容量瓶中，随后按照标准曲线的制备方法进行配制，测定其吸光度［9］，从标准曲线上读出供试样品溶液中相对芦丁的量，再计算得总黄酮的含量。

1.2.4蜈蚣草甲醇提取物的抗氧化试验

还原作用、脂质过氧化抑制作用、DPPH清除作用、超氧阴离子（O2-·）清除作用、羟基自由基（·OH）清除作用、过氧化氢（H2O2）清除作用按照文献［10-13］的方法测定。

1.3定性和定量分析

用质量频谱值与NIST98标准质谱数据库的标准图谱进行比对，鉴定出蜈蚣草甲醇提取物中的化学成分；按峰面积归一化法计算各化合物在提取物中的相对百分含量。

2　结果与分析

2.1蜈蚣草甲醇提取物的GC–MS分析结果

用GC-MS技术对蜈蚣草甲醇提取物进行成分分析，得到总离子流图（图1）。对图1中各峰进行质谱扫描，结果见表1。根据NIST98标准质谱数据库鉴定出24个化合物，其中，叶绿醇、油酸乙酯、棕榈酸甲酯的含量均较高，分别为17.78%、16.84% 和15.95%；其他组分的含量较低。这些组分中，酯类最多，占总量的54.22%；其后依次为醇类、黄酮类、酸类和吲哚类，分别占总量的24.03%、10.44%、6.73%和1.34%。

图1　蜈蚣草甲醇提取物的总离子流图Fig. 1 Total ion flow chart of methanol extract of Pteris vittata

表1　蜈蚣草甲醇提取物的化学成分分析Table 1 Chemical composition analysis of methanol extract of Pteris vittata

2.2蜈蚣草甲醇提取物中的总黄酮含量

采用紫外-可见分光光度法对蜈蚣草甲醇提取物中的总黄酮含量进行测定，以芦丁为阳性对照，硝酸铝为显色剂，得标准曲线回归方程。

y = 0.063 1x - 0.016，R2= 0.928 9。由方程计算得到蜈蚣草甲醇提取物中的总黄酮含量为4.81%。

2.3蜈蚣草甲醇提取物的还原能力

由试验结果可知，在一定浓度范围内，蜈蚣草甲醇提取物和Trolox阳性对照的还原能力与蜈蚣草提取物的质量浓度呈正相关，浓度越高，还原力越强。在测试浓度范围内，Trolox的还原能力均高于蜈蚣草提取物。蜈蚣草提取物还原能力的回归方程y= 1.514 5x + 6.326 3（R2= 0.970 7）；Trolox还原能力的回归方程y = 1.689 9x + 6.796 9（R2=0.955 3）。由方程计算可得蜈蚣草提取物与Trolox总还原力的EC50值分别为0.31、0.35 mg/mL。

2.4蜈蚣草甲醇提取物的脂质过氧化抑制率

蜈蚣草甲醇提取物的脂质过氧化抑制作用与浓度表现出正相关关系，浓度越高，脂质过氧化的抑制率越强，则抗氧化能力越强。在测试浓度范围内，蜈蚣草甲醇提取物的脂质过氧化抑制率平稳增加；当蜈蚣草提取物的质量浓度为 1.28 mg/mL时，Trolox对脂质过氧化的抑制率（34.7%）高于蜈蚣草提取物的抑制率。蜈蚣草提取物对脂质过氧化抑制率的回归方程y =0.783 7x+4.360 4 （R2=0.852 5）；Trolox脂质过氧化抑制率的回归方程 y =0.524 3x+4.458 1 （R2=0.966 8）。计算得蜈蚣草甲醇提取物和Trolox对脂质过氧化的EC50值分别为6.55、10.80 mg/mL。

2.5蜈蚣草甲醇提取物对DPPH自由基的清除率在测试浓度范围内，除0.63 mg/mL时，蜈蚣草提取物对DPPH自由基清除率高于Trolox对照的清除率；当蜈蚣草提取物质量浓度为 5.00 mg/mL时，蜈蚣草甲醇提取物的清除率最高，达到87.4%。蜈蚣草提取物对 DPPH自由基清除率的回归方程y=0.551 9x+5.461 3，Trolox对DPPH自由基清除率的回归方程y=0.794 2x+5.087 8。由回归方程计算出蜈蚣草甲醇提取物和 Trolox 对 DPPH自由基的EC50分别为0.15、0.78 mg/mL。

2.6蜈蚣草甲醇提取物对超氧阴离子的清除率

试验结果表明，蜈蚣草提取物质量浓度为2.56 mg/mL时，蜈蚣草甲醇提取物对超氧阴离子的清除率达到70.40%，对照Trolox的清除率为66.30%。蜈蚣草提取物对超氧阴离子的清除率的回归方程y =0.416x+5.462 7（R2=0.965 3）；Trolox对超氧阴离子的清除率的回归方程y=0.411x+5.234 1（R2=0.991 7）。计算得出蜈蚣草提取物对超氧阴离子的EC50分别为0.09、0.58 mg/mL。

2.7蜈蚣草甲醇提取物对羟基自由基的清除率

试验结果表明，在测试浓度范围内，蜈蚣草提取物对羟基自由基的清除率随质量浓度的增加，对羟基自由基的清除率增强。当质量浓度为0.16 mg/mL和0.32 mg/mL时，蜈蚣草提取物对羟基自由基的清除率低于对照Trolox；其他浓度时，均高于对照。由计算可得蜈蚣草甲醇提取物对羟基自由基的EC50为4.11 mg/mL，Trolox对羟基自由基的EC50为3.69 mg/mL。

2.8蜈蚣草甲醇提取物对过氧化氢的清除率

在测试的浓度范围内，样品和对照对过氧化氢的清除作用随浓度增加而增强。当测试质量浓度为1.25 mg/mL时，蜈蚣草甲醇提取物对过氧化氢的清除率达到62.0%，高于对照Trolox的清除率（56.0%）。蜈蚣草提取物对过氧化氢清除率的回归方程y =0.763 9x+5.261 7（R2=0.971 3）；Trolox对过氧化氢清除率的回归方程y=0.976 7x+5.121 7（R2=0.951 5）。计算得出蜈蚣草甲醇提取物和Trolox对过氧化氢的EC50分别为0.45、0.75 mg/mL。

3　结论与讨论

本试验采用甲醇渗漉法浸提蜈蚣草，并结合GC-MS对蜈蚣草提取物进行成分分析，鉴定出24种化合物，包含酯类、醇类、黄酮类、酸类和吲哚类物质，其中以酯类为主，占54.22%，提取物中总黄酮含量4.81%。以水溶性维生素E（Trolox）作阳性对照，研究蜈蚣草甲醇提取物的抗氧化活性，结果表明，蜈蚣草甲醇提取物具有较好的抗氧化作用，在测试浓度范围内与剂量呈正相关，蜈蚣草提取物的还原作用、脂质过氧化抑制作用、对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基和过氧化氢的EC50分别为0.31、6.55、0.15、0.09、4.11、0.45 mg/mL。

［1］ 尹怀约．蜈蚣草的组织培养［J］．四川师范学院学报（自然科学版），1991，12（1）：20-22．

［2］ 中国科学植物研究所．中国境内酸性土钙质土和盐碱土的指示植物［M］．北京：中国科学院出版社，1954．

［3］ 陈同斌，张斌才，黄泽春，等．超富集植物蜈蚣草在中国的地理分布及其生境特征［J］．地理研究，2005，24（6）：825-833．

［4］ 石晓云．蜈蚣草资源的利用［J］．特种经济动植物，2010，13（2）：28．

［5］ 周向军，高义霞，杨宗琪，等．蜈蚣草总黄酮体外抗氧化作用的研究［J］．资源开发与市场，2010，26（4）：294-296．

［6］ 孙俊，丁利君，李梅艳．纤维素酶-微波联合提取蜈蚣草黄酮及其抗氧化研究［J］．时珍国医国药，2011，22（4）：854-856．

［7］ 丁利君，苏桂良．微波辅助提取蜈蚣草黄酮及其抗氧化［J］．食品与生物技术学报，2009，28（5）：623-626．

［8］ 袁瑜，张良，李玉锋，等．渗漉法提取白芷总香豆素的工艺研究［J］．时珍国医国药，2008，19（2）：302-303．

［9］ 刘硕，蒋道松，李娈．斑地锦与地锦总黄酮含量及抗氧化活性比较［J］．湖南农业大学学报（自然科学版），2007，33（3）：287-288．

［10］ 王静，刘大川．紫（白）苏叶黄酮类化合物抗氧化性能的研究［J］．中国油脂，2004，29（3）：33-36．

［11］ 郭长江，杨继军，韦京豫，等．两种方法测定坚果类食物抗氧化活性的比较［J］．中国食品卫生杂志，2004，16（2）：135-136．

［12］ 郑义，邵颖，陈安徽，等．益智仁总黄酮超声辅助提取工艺优化及其抗氧化活性［J］．食品科学，2014，35（6）：44-60．

［13］ Zhu C H，Lei Z L，Luo Y P．Studies on antioxidative activities of methanol extract from Murraya paniculata［J］. Food Science and Human Wellness，2015，4（3）：108-114．

责任编辑：尹小红

英文编辑：梁 和

Antioxidant activities of methanol extract of Pteris vittata

Hou Wencheng， Han Dandan， Chen Manli， Luo Yanping*
（College of Environment and Plant Protection， Hainan University， Haikou 570228， China）

Pteris vittata was extracted with percolation method by methanol， composition of the extract was identified by GC-MS， antioxidant activities of the methanol extract were evaluated by six common tests and Trolox was used as positive control. The results showed that： the highest content of methanol extract was esters， account for 54.22%， alcohol was the second， account for 24.03%， and ketones， acids and indoles matter were 10.44%， 6.73% and 1.34% respectively. The flavonoids content of extract was 4.81%. DPPH scavenging activity was stronger at the six tests compare with Trolox，and the EC50value was 0.15 mg/mL， the EC50of lipid oxidation inhibition， superoxide， hydroxyl radicals and hydrogen peroxide scavenging activity were 6.55， 0.09， 4.11， 0.45 mg/mL respectively.

Pteris vittata； methanol extract； flavonoids； antioxidant activity

侯文成（1991—），男，陕西旬邑县人，硕士研究生，主要从事天然产物研究，86473999@qq.com； *通信作者，骆焱平，教授，主要从事天然产物研究，Yanpluo@126.com

TS201.4

A

1007-1032（2016）04-0441-04

2016-03-22 修回日期：2016-06-13

2014年度海南省应用技术研发与示范推广专项（ZDXM2014115）