耐铜菌株4bs的鉴定及其对染料脱色的效果

孙海琼，汪春蕾

（东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040）



耐铜菌株4bs的鉴定及其对染料脱色的效果

孙海琼，汪春蕾*

（东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

从土壤中筛选出1株具有较高漆酶活性的菌株，经分子生物学方法鉴定，该菌株为芽孢杆菌属细菌，将其命名为Bacillus sp. 4bs。菌株4bs的最适生长温度和pH分别为37 ℃和7.0，其在6%（w/v）NaCl溶液中能够正常生长，在含有2.0 mmol/L Cu2+的培养基中仍生长旺盛。以丁香醛连氮为底物，菌株4bs的芽孢漆酶活性为35.66 U/g（干重），其芽孢漆酶最适反应温度为80 ℃，最适反应pH值为6.8；0.1 mmol/L的半胱氨酸、二硫苏糖醇和叠氮化钠抑制其活性，10 mmol/L的Na+、K+、Cu2+和Li+能够增强其活性。在pH 6.8的体系中，菌株4bs芽孢漆酶对结晶紫和茜素红在6 h内的脱色率分别为83.57%和77.16%；加入乙酰丁香酮（Ace）作介体时，对靛红的脱色率由52.73%提高到94.98%，对活性黑5的脱色率由19.01%提高到90.10%。

细菌漆酶；芽孢杆菌；染料脱色；铜抗性

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漆酶（EC1.10.3.2，laccase）是自然界广泛分布的多铜氧化酶家族中的一员［1］，它能利用分子氧作为电子受体氧化多种酚类及非酚类的化合物，同时将分子氧还原为水［2］。近年来，漆酶在环境科学领域已成为一大研究热点。真菌漆酶分泌于胞外，分析研究方便，所以，关于真菌漆酶的研究较多。Alexandre等［3］在原核生物中也发现了漆酶。细菌漆酶大部分为单体酶，其热稳定性好，结构上无需糖基化；芽孢漆酶的适用pH范围广，能更好地降解偏碱性的染料及废水［4-8］，因此，漆酶在工业应用中具有更广阔的前景。

在纺织业、医药和化妆品等工业生产中需要用到大量染料，染料废液的处理有待研究。大多染料的结构较为复杂，稳定性较高，可降解性差，在印染过程中对环境的污染严重。传统的化学或物理处理方法很有可能在降解过程中造成二次污染［9］。采用生物学方法处理染料是较为环保的方式。采用酶制剂降解染料废水不仅效率高，而且操作简单。漆酶是在染料降解与废水脱色方面应用最为广泛的一种酶制剂［10-11］。

为了探寻可对染料废水进行生物处理的新菌株，笔者从东北林业大学实验林场白桦林下的土壤中分离出1株具有较高漆酶活性的菌株，对该菌株进行鉴定，并研究该菌株芽孢漆酶的性质，利用其芽孢漆酶对偶氮、蒽醌、靛蓝及三苯甲烷类染料进行脱色，取得了较好的脱色效果，现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1材料

土样采自东北林业大学实验林场白桦林下。

Taq DNA Polymerase、B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒、溶菌酶和大肠杆菌DH5-α感受态细胞购自北京TIANGEN公司；DNA Marker DL2000、dNTP（2.5 mmol/L）、pMD18-T载体购自TaKaRa公司；氨苄青霉素、丁香醛连氮、结晶紫、靛红、活性黑5和茜素红购自Sigma公司；其他的常规试剂均为国产、分析纯制品。

1.2方法

1.2.1菌株的筛选与纯化

菌株的筛选与纯化方法见参考文献［12］。利用丁香醛连氮对筛选出的单菌落进行定性检测，选取1株长势较好的菌株进行后续研究。

1.2.2菌株生长特性的观测

该菌株的革兰氏染色方法及该菌株的生理生化特性测定方法参见文献［13］。

1.2.3菌株的16S rDNA序列分析

菌株总DNA的提取方法见参考文献［14］。以菌株的总DNA为模板，利用细菌16S rDNA的通用引物［15］进行PCR。PCR反应体系：灭菌蒸馏水35.5 μL，10×PCR Buffer（含15 mmol/L MgCl2）5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，2.5 μmol/L的引物27F和1492R 各1.5 μL，DNA模板2 μL，5 U/μL Taq Polymerase 0.5 μL。反应条件参考文献［12］。

采用胶回收试剂盒回收目的片段，与pMD18-T载体连接后进行转化。利用其对氨苄青霉素的抗受性进行菌落筛选，经PCR检测出条带，然后送华大基因公司进行测序。在 NCBI上将测序结果进行BLAST同源比对分析，选取一些同源性较高的序列经ClustalX比对后，采用最大简约法，用Phylip软件构建系统进化树。

1.2.4菌株的生物学特性研究

研究不同温度（15～55 ℃）、pH值（3～10）、NaCl浓度（质量分数为 1%～10%）和 Cu2+浓度（0.2～6.0 mmol/L）对菌株生长的影响。将菌株活化后按1%的接种量分别接种于不同条件的LB培养基中，37 ℃培养12 h，测定OD600 nm，重复测定3次。

1.2.5菌株芽孢漆酶的酶学性质研究

利用含0.2 mmol/L Cu2+的LB固体培养基大量培养该菌株，37 ℃倒置培养5～7 d，参见文献［14］制备芽孢漆酶悬液。以丁香醛连氮为底物检测漆酶的活性，反应体系：0.5 mL的1 mmol/L丁香醛连氮溶液，50 μL芽孢漆酶悬液，2.45 mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 6.8）。设置空白对照（体系中不加芽孢漆酶悬液）。37 ℃反应3 min后测OD525nm，重复测定3次。将1 min内氧化1 μmol底物所需的酶量定义为一个酶活单位。取1 mL芽孢悬液，在80 ℃下烘干至恒重，计算每1 g芽孢（干重）所具有的漆酶的活性。

研究温度、pH值、抑制剂和金属离子对芽孢漆酶活性的影响，反应体系均为3 mL，其中金属离子终浓度均为10 mmol/L，抑制剂十二烷基硫酸钠（SDS）、叠氮化钠（NaN3）、二硫苏糖醇（DTT）和半胱氨酸（Cysteine）的终浓度均设 3个梯度（0.1、1.0、10 mmol/L），乙二胺四乙酸二钠（EDTA）的终浓度设 5个梯度（0.1、1.0、10、50、100 mmol/L），具体操作方法参见文献［14］。

1.2.6菌株芽孢漆酶对染料脱色影响的研究

所用染料结构、终浓度及其最大吸收波长见表1。染料脱色体系缓冲液的pH值为该菌株芽孢漆酶的最适pH 6.8。反应总体积为6 mL，其中芽孢漆酶悬浮液 50 μL，介体乙酰丁香酮（Ace）的终浓度为 0.1 mmol/L，于40 ℃、160 r/min摇床中进行脱色。在相应的波长下测定染料的光密度值。以不含芽孢漆酶的体系为空白对照，计算芽孢漆酶对染料的脱色率。脱色率R=（A0-A）/A，其中A为定期取样时染料的光密度值，A0为初始染料的光密度值。

2　结果与分析

2.1具有漆酶活性菌株的筛选与纯化结果

经过丁香醛连氮的定性检测，在白桦林下的土壤样品中筛选并纯化 10株具有漆酶活性的菌株。选取1株显深红色的菌株（将其编号为4bs）进行后续研究。

2.2菌株的生长特性

菌株4bs革兰氏染色显蓝紫色，为革兰氏阳性菌，具有芽孢。该菌株能够利用葡萄糖、阿拉伯糖和果糖等单糖和蔗糖、乳糖和麦芽糖等，不能利用的糖类有甘露醇、肌醇、山梨醇、密二糖、鼠李糖和甘露糖。

菌株4bs的16S rDNA序列全长为1 513 bp，在NCBI上经BLAST同源性分析的结果表明，该菌株与多种芽孢杆菌的同源性达到99%，结合16S rDNA序列分析以及该菌株的生长特性，可确定 4bs为芽孢杆菌属菌株，故将其命名为Bacillus sp. 4bs。以16S rDNA序列构建的该菌株的系统进化树如图1所示。

图1　菌株4bs的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of the strain 4bs

菌株4bs的最适生长温度为37 ℃，在20～42 ℃均能生长（图2）；最适生长pH值为7.0，在pH 5.0～8.0菌株生长良好（图3）；在质量分数为1%～6%的NaCl溶液中可以正常生长（图4）；在含0.2～2.0 mmol/L Cu2+的培养基中可以正常生长，4.0～6.0 mmol/L Cu2+轻度抑制其生长（图5）。可见，该菌株对NaCl溶液和Cu2+的抗性都比较强，适合用于对工业废水进行处理。

图2　菌株4bs在不同生长温度的OD600 nmFig.2 OD600 nmof the strain 4bs at different temperatures

图3　 菌株4bs在不同pH的OD600 nmFig. 3 OD600 nmof the strain 4bs at different pH

图4　菌株4bs在不同浓度NaCl下的OD600nmFig.4 OD600 nmof the strain 4bs at different concentration of NaCl

图5　 菌株4bs在不同浓度Cu2+下的OD600nmFig.5 OD600 nmof the strain 4bs at different concentration of Cu2+

2.3菌株4bs芽孢漆酶的酶学性质

以丁香醛连氮为底物，测定菌株4bs芽孢漆酶的活性为35.66 U/g（干重）。

菌株4bs芽孢漆酶在80 ℃时的酶活最大，在37～90 ℃均具有较高的酶活（图6），其最适酶活温度比真菌漆酶的最适温度高10～30 ℃［16］，其最适反应pH值为6.8，在pH为6.0～7.5时酶活较高（图7）。终浓度均为10 mmol/L的Na+、K+、Cu2+和Li+能够增强菌株4bs芽孢漆酶的活性，而终浓度均为10 mmol/L的Mn2+、Fe2+、Ag+、Hg2+和Fe3+都强烈抑制其活性（表2）。

图6　 菌株4bs芽孢漆酶在不同温度下的相对酶活性Fig.6 Relative enzyme activity of spore laccase in strain 4bs at different temperatures

图7　 菌株4bs芽孢漆酶在不同pH下的相对酶活性Fig.7 Relative enzyme activity of spore laccase in strain 4bs at different pH

表2　在终浓度为10 mmol/L的金属离子作用下菌株4bs的芽孢漆酶活性Table 2 Effects of metal ions at the final concentration of 10 mmol/L on spore laccase activity of the strain 4bs

0.1mmol/L Cysteine和DTT强烈地抑制菌株4bs芽孢漆酶的活性。0.1 mmol/L的EDTA对芽孢漆酶的活性有轻微的促进作用，EDTA的浓度大于50 mmol/L时对芽孢漆酶活性有一定的抑制作用。浓度大于1 mmol/L的SDS和NaN3都对芽孢漆酶活性有一定的抑制作用（表3）。

表3　不同抑制剂作用下菌株4bs的芽孢漆酶活性Tab.3 Effects of different inhibitors on spore laccase activity of the strain 4bs

2.4菌株4bs的芽孢漆酶对染料脱色的效果

菌株4bs的芽孢漆酶在pH 6.8的条件下，6 h内对结晶紫（三苯甲烷类）、茜素红（蒽醌类）、靛红（靛蓝类）和活性黑5（偶氮类）的脱色率分别为83.57%，77.16%，52.73%和19.01%（图8），说明该芽孢漆酶对三苯甲烷类染料的脱色效果较好。体系中加入介体乙酰丁香酮（Ace），芽孢漆酶在6 h内对这4种染料的脱色率都达到了80%以上，对靛红和活性黑5的脱色率有较显著的提高，分别提高到 94.98%和90.10% （图9）。

图8　菌株4bs芽孢漆酶在不同脱色时间对4种染料的脱色率Fig.8 Decolorization of 4 kinds of dyes by spore laccase in the strain 4bs at different time

图9　添加乙酰丁香酮后菌株4bs芽孢漆酶在不同脱色时间对4种染料的脱色率Fig. 9 Decolorization of 4 kinds of dyes with acetosyringone by spore laccase in the strain 4bs at different time

3　结论与讨论

菌株4bs具有很好的耐铜特性，这一特性使得该菌株容易被筛选出来。菌株4bs对Cu2+的抗性较强，在含2 mmol/L Cu2+的培养基中仍能正常生长。与文献报道的研究结果（芽孢杆菌属菌株CLb在Cu2+浓度为0～0.6 mmol /L时可正常生长［12］；枯草芽孢杆菌WD23在含0～0.2 mmol/L Cu2+的培养基中可以正常生长［14］；芽孢杆菌9BS在含有0.2 mmol/L Cu2+培养基中能够生长［17］）相比较，菌株4bs对Cu2+的抗性非常强，这是它独有的特性。

Cu2+是漆酶催化中心的辅助因子［18］，在漆酶转录后的折叠与组装中也是必需的［19］。漆酶的活性依赖于 Cu2+的研究结果［20］已在细菌漆酶和真菌漆酶中得到证实。本研究中Cu2+能够增强菌株4bs芽孢漆酶的活性，10 mmol/L Cu2+能够使其活性增强104.5%。工业废水中常含有Cu2+，Cu2+的浓度超过一定范围就会干扰漆酶的活性，所以，漆酶对Cu2+的耐受性也受到特别关注［21］。

大多数真菌漆酶在酸性pH范围内具有活性，如灵芝漆酶在pH值2.2～2.6具有活性［22］，血红密孔菌以ABTS为底物时的最适反应pH值为2.4，pH值大于3.0时抑制该酶活性［23］，丝孢菌（Monodictys asperospera）的漆酶在pH值为6.0时的活性最高，而细菌漆酶大多数在中性至碱性范围内具有活性［24］，细菌菌株WD23的漆酶最适反应pH值为6.8［25］。本研究中菌株 4bs的芽孢漆酶最适反应 pH值为6.8，在强碱（pH值9.0）环境下仍具有活性。

本研究中0.1 mmol/L的Cysteine和DTT以及10 mmol/L的NaN3对菌株4bs芽孢漆酶有明显的抑制作用。据报道，DTT和Cysteine也能够强烈抑制解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）LS05的芽孢漆酶活性，0.1 mmol/L的NaN3也可使其酶活丧失30%左右［26］；10 mmol/L的EDTA、0.1 mmol/L 的DTT和10 mmol/L的NaN3能够完全抑制子囊菌（Paraconiothyrium variabile）漆酶的活性［27］，丝状真菌（Aspergillus ochraceus）NCIM-1146的漆酶活性被NaN3、EDTA、DTT和Cysteine强烈抑制［28］，可见，这几种漆酶抑制剂对细菌漆酶的作用和对真菌漆酶的作用相似。本研究中菌株4bs的芽孢漆酶对三苯甲烷类染料结晶紫和蒽醌类染料茜素红具有较好的脱色效果，在pH值6.8时，脱色6 h对结晶紫的脱色率达83.57%，对茜素红的脱色率达77.16%（漆酶Lac3T93在pH为8.0的脱色体系中12 h使结晶紫脱色10%左右，凤尾菇漆酶经过5 d对结晶紫的脱色率约 44%［29］）。介体通常能够增强漆酶对染料的脱色率，加入介体乙酰丁香酮后，菌株4bs芽孢漆酶对偶氮类染料活性黑 5的脱色率由 19.01%提高至 90.10%，对靛蓝类染料靛红的脱色率由52.73%提高至94.98%。

菌株4bs芽孢漆酶适于对高盐度和高pH工业废水进行处理，在没有介体的情况下对结晶紫和茜素红有较好的脱色效果，在介体乙酰丁香酮作用下对靛红和活性黑的脱色率提高，可见，菌株 4bs的芽孢漆酶在染料废水脱色方面具有较大的应用潜力。

本研究结果表明：筛选出的菌株 4bs对铜离子和NaCl都具有很强的耐性，其芽孢漆酶最适反应温度为80 ℃，最适反应pH值为6.8，半胱氨酸、二硫苏糖醇和叠氮化钠抑制其活性，Na+、K+、Cu2+和Li+能够增强其活性，其芽孢漆酶对多种染料具有较好的脱色效果，是很有潜力的治理废水的菌株。

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责任编辑：王赛群

英文编辑：王 库

Identification of the copper tolerance strain 4bs and its effects on dye decolorization

Sun Haiqiong， Wang Chunlei*
（College of Life Sciences， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

A novel strain showing high laccase activity was separated from soil using screening agent， the strain was identified as Bacillus from classical and molecular biological methods, and named by Bacillus sp. 4bs. The optimum temperature and pH for the strain growth was 37 ℃ and 7.0， respectively. It cloud normal grow in solution of 6% NaCl （w/v） or 2.0 mmol/L Cu2+. The spore laccase activity was 35.66 U/g by dry weight in the substrate with syringaldazine. The optimum reaction temperature and pH for spore laccase of the strain was 80 ℃ and 6.8， respectively， its activity could be strongly inhibited with 0.1 mmol/L Cysteine， DTT， and NaN3， while， 10 mmol/L Na+， K+， Cu2+， and Li+could increase its activity. The spore laccase of the strain could decolorize 83.57% of crystal violet and 77.16% of alizarin red at pH 6.8 without mediator， however， the decolorization rate of isatin and reactive black 5 was increased from 52.73% and 19.01% to their 94.98% and 90.10% respectively when acetosyringone was added as a mediator.

bacterial laccase； dye decolorization； copper tolerance； phylogenetic tree

孙海琼（1993—），女，甘肃兰州人，主要从事微生物学研究，626343869@qq.com；*通信作者，汪春蕾，博士，副教授，主要从事微生物学研究，wcls-1972@163.com

X172；X788；S188

A

1007-1032（2016）04-0403-06

2015-11-10 修回日期：2016-06-26

国家自然科学基金项目（J1210053）