感染人乳头状瘤病毒的人喉咽鳞癌FaDu细胞系的建立

路武豪郭文涛冯 龙娄卫华*（ 郑州大学第一附属医院耳鼻喉科，河南 郑州 45005； 广东医科大学基础医学院，广东 东莞 5808； 河南中医学院基础医学院病原生物学与免疫学科，河南 郑州 450008）

感染人乳头状瘤病毒的人喉咽鳞癌FaDu细胞系的建立

路武豪1郭文涛2冯 龙3娄卫华1*
（1 郑州大学第一附属医院耳鼻喉科，河南 郑州 450052；2 广东医科大学基础医学院，广东 东莞 523808；3 河南中医学院基础医学院病原生物学与免疫学科，河南 郑州 450008）

目的 建立稳定感染人乳头状瘤病毒（HPV）阳性的人喉咽鳞癌FaDu细胞系，为体外研究下咽鳞癌提供理想的实验模型。方法 重组HPV-16 E6-E7慢病毒，并用其感染人喉咽鳞癌FaDu细胞。RT-PCR和Western blot检测慢病毒稳定感染的FaDu细胞E6、E7 mRNA和蛋白表达情况。结果 获得稳定感染重组HPV-16 E6-E7慢病毒的FaDu细胞。结论 成功建立人乳头状瘤病毒感染的人喉咽鳞癌FaDu细胞系。

感染；人乳头状瘤病毒；人喉咽鳞癌；FaDu细胞

喉鳞癌和喉咽鳞癌是HNSCC中两种常见恶性肿瘤，多发于中老年男性，大量抽烟和（或）饮酒是其公认的致癌因素，然而有一部分患者并无大量抽烟和（或）饮酒的病史，针对这部分患者的发病原因，研究者将目光转向了HPV感染［1］。目前报道喉鳞癌HPV感染率的文献很多，但鲜有喉咽鳞癌HPV感染情况的报道，HPV在喉咽鳞癌中的感染率及常见感染型别均不明确。为了便于体外深入研究HPV 感染的人喉咽鳞癌的发生、发展规律及HPV 与喉咽鳞癌演进的关系，我们运用慢病毒感染的方法建立了HPV阳性的人喉咽鳞癌细胞株，为体外研究喉咽鳞癌提供了理想的细胞模型。

1 材料与方法

1.1 细胞株：人喉咽鳞癌FaDu细胞、人喉癌hep-2细胞和人胚肾细胞HEK293T细胞株均购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库。

1.2 制备重组HPV-16 E6-E7慢病毒：全基因合成HPV-16 E6-E7基因，并在两端分别加上HindIII和KpnI限制性核酸内切酶位点，与慢病毒载体pLV-EGFP-C在T4连接酶的作用下连接，将连接体系转化入DH5α感受态细菌，挑选长出的菌落进行测序鉴定，即得到重组HPV-16 E6-E7慢病毒。

1.3 细胞分组情况：细胞共分为3组：实验组（重组HPV-16 E6-E7慢病毒稳定感染的FaDu细胞）、载体对照组（慢病毒空载体稳定感染的FaDu细胞）、空白对照组（未感染慢病毒的FaDu细胞）。

1.4 重组HPV-16 E6-E7慢病毒的包装：提取HPV-16 E6-E7慢病毒质粒。将Polyfect-V转染试剂和慢病毒质粒按照以下比例进行混合，转染入293T细胞。转染后48 h收集细胞培养上清，500 g离心10 min去除细胞碎片，进行病毒滴度测定，-80 ℃冻存。

1.5 E6、E7 DNA PCR检测：参照QIAGEN公司基因组提取试剂盒提取慢病毒稳定感染人喉咽鳞癌FaDu细胞的基因组DNA。PCR扩增鉴定E6、E7 DNA存在情况。

1.6 RT-PCR检测FaDu细胞中HPV-16 E6、E7 mRNA表达：Trizol法提取各组细胞总RNA，用AMV酶逆转录成cDNA，采用TaqMan探针荧光进行检测各组细胞中E6/E7 mRNA表达水平。

2 结 果

2.1 重组HPV-16 E6-E7慢病毒的制备结果：重组HPV-16 E6-E7慢病毒测序结果与设计序列进行同源性比较分析，结果显示目的DNA E6-E7序列在750～1000 bp靠近750 bp处有明亮条带，与设计分子量一致。慢病毒滴度测定结果：重组HPV-16 E6-E7慢病毒滴度为1.15×108MOI，空载体慢病毒滴度为2.09×108MOI。

2.2 HPV-16 E6-E7 DNA已整合入FaDu细胞基因组：收集细胞（约5× 106）提取基因组DNA，E6和E7基因分别PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统分析照相，可见474 bp的HPV-16 E6 DNA条带和297 bp的HPV-16 E7 DNA条带，与设计完全一致，证实HPV-16 E6-E7 DNA已整合入FaDu细胞基因组。

2.3 慢病毒稳定感染FaDu细胞E6、E7 mRNA和蛋白均有高水平表达：重组HPV-16 E6-E7慢病毒感染FaDu细胞中可见明亮的绿色荧光蛋白EGFP的表达。慢病毒稳定感染FaDu细胞E6、E7 mRNA和蛋白均有高水平表达，与已知整合有HPV的Hep-2细胞的表达水平一致，见图1。

图1 慢病毒稳定感染FaDu细胞中E6/E7表达水平均明显升高（A.慢病毒感染的FaDu细胞中可见明亮的绿色荧光蛋白EGFP的表达；B.慢病毒稳定感染FaDu细胞E6、E7 mRNA均有高水平表达，与已知整合有HPV的Hep-2细胞的表达水平一致；C.慢病毒稳定感染FaDu细胞与已知整合有HPV的Hep-2细胞均有明显的E6、E7 蛋白印迹条带，而空载体对照FaDu细胞、未转染的FaDu细胞则无印迹出现）

3 讨 论

本课题所建立的HPV阳性的人喉咽鳞癌系为从分子生物学水平探讨人喉咽鳞癌的发病机制、治疗及预防提供了理想的体外模型。目前的喉癌细胞株如Hep-2细胞系，来自于高加索黑人，为表皮样癌，能够检测到HPV-18 DNA的存在。国内仅见1例喉癌细胞系建立的报道但其未进行HPV DNA的检测［2］。

合适的载体是将HPV-16 E6-E7基因整合入FaDu细胞中的重要环节。慢病毒载体具有操作简便、感染效率高、可感染细胞种类多、转移基因片段容量大、作用稳定、安全性好等优点，是将基因整合入细胞的良好运载工具［3］。本课题通过全基因合成的方法合成HPV-16 E6和E7基因，在两个基因中间插入一段编码10个中性氨基酸的柔性链，以确保E6、E7基因在整合入宿主基因组后可以独立表达E6、E7蛋白。将合成的目的基因与慢病毒载体pLV-EGFP-C重组后测序，结果显示目的DNA E6-E7序列与设计序列完全一致，得到正确的重组慢病毒载体，对重组慢病毒载体进行包装、滴度测定，获得可用于转染实验的慢病毒载体。将带有目的基因的慢病毒载体和空载体转染入人喉咽鳞癌细胞FaDu细胞中，稳定培养，采用TaqMan探针荧光检测法分别扩增E6、E7和内参β-actin，Western-blot检测E6、E7蛋白，阴性对照为未转染慢病毒载体的FaDu细胞，阳性对照为已知感染有高危型HPV的人喉癌Hep-2细胞，结果证实实验组慢病毒载体成功将目的基因整合入FaDu细胞，并稳定表达E6、E7蛋白。

综上所述，HPV阳性的FaDu细胞系的建立有助于研究HPV 感染的人喉咽鳞癌，并对深入研究HPV 与喉咽鳞癌的关系也具有重要意义。

［1]吴余，崔静，王虹，等.HPV16相关宫颈癌组织中MUC16和E6表达的关系［J］.郑州大学学报（医学版），2015，50（1）: 41-44.

［2]蔡萍，吴展元，李金荣，等.人乳头瘤病毒阴性的喉鳞癌细胞系的建立［J］.中华病理学杂志，2005，34（8）: 533-536.

［3]刘宏侠，吴蒙，孙玉满，等.HPV感染及P53与CdC2蛋白表达对喉癌术后复发的预测价值［J］.中华肿瘤防治杂志，2015，22（7）: 519-523.

R739.6

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1671-8194（2016）18-0036-02

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