γ-GCS及TGF-β1在MRL/1pr雌性小鼠肾组织表达研究

张北平　刘树锋　王　海　谭　校（汕头大学医学院附属粤北人民医院风湿免疫科　韶关　512026）

γ-GCS及TGF-β1在MRL/1pr雌性小鼠肾组织表达研究

张北平刘树锋王海谭校（汕头大学医学院附属粤北人民医院风湿免疫科韶关512026）

摘要：目的：对狼疮小鼠肾组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）表达水平进行研究，发现γ-GCS的表达量改变在转化生长因子β1（TGF-β1）促纤维化中的作用。方法：以C57BL/6小鼠为对照，荧光定量PCR法检测MRL/1pr雌性小鼠肾组织γ-GCS和TGF-β1的mRNA表达。结果：狼疮小鼠组肾组织中γ-GCS的mRNA及蛋白表达减少，TGF-β1的mRNA表达水平升高，与C57BL/6小鼠组比较有显著差异（P＜0.05）。结论：γ-GCS表达降低导致谷胱甘肽（GSH）合成减少，抗氧化能力减弱，促使肾间质纤维化。

关键词：狼疮性肾炎 转化生长因子 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种累及多系统的疾病，狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是最常见器官损害，免疫损伤联合炎症反应，导致肾组织中活性氧簇含量增加［1］，同时抗氧化剂GSH含量减少，氧化-抗氧化失衡造成组织损害，最终发展到肾间质纤维化的不可逆性损害。转化生长因子（TGF-β1）与LN肾间质纤维化过程中最重要的促纤维化因子，表达影响着肾组织的纤维化进展。谷胱甘肽（GSH）是机体最重要的抗氧化损害物质，在LN中起到重要作用，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）为合成GSH的关键限速酶，γ-GCS的活性和表达水平直接影响GSH的水平，是维持细胞内GSH稳态的主要决定因素。本研究在MRL/1pr雌性小鼠模型中，从转录水平研究TGF-β1和γ-GCS在狼疮鼠肾组织的表达，探讨GSH合成限速酶γ-GCS在MRL/1pr的表达在LN肾氧化应激及间质纤维化中的作用。

1资料与方法

1.1研究资料：正常组小鼠：SPF级C57BL/6小鼠；自发性狼疮性肾炎模型组：MRL/1pr雌性小鼠，各10只，均为雌性。

1.2实验方法：试剂Trizol Reagent（Invitrogen公司），PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒（宝生物工程有限公司），PCR引物合成（上海英骏生物技术有限公司）。两组小鼠培养至16周时断颈处死，无菌环境下取出肾脏，用Trizol Reagent分别提取两组小鼠肾组织总RNA（按照试剂盒方法操作）。用荧光定量PCR方法检测总RNA中TGF-β1、γ-GCS的mRNA水平，反应按照试剂盒说明采用2步法完成。设计引物：内参GAPDH（150bp）F：TGTGTCCGTCGTGGATCTGA，R：TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG；TGFβ1 （92bp）F：TTTCCGCTGCTACTGCAAGTC，R：AGGGCTGTCTGGAGTCCTCA；γ-GCS（132bp）F：TGCACATCTACCACGCAGTCAA，R：GAACATCGCCTCCATTCAGTAACA，实验条件 95℃5min→94℃10s→59℃，33个循环。以稀释的cDNA浓度梯度制作标准曲线。

2实验结果（表1）

TGF-β1半定量PCR结果：狼疮组TGF-β1mRNA的表达高于正常组（P＜0.05）。狼疮组γ-GCS的mRNA表达较正常组减少（P＜0.05）。

3讨论

表1

肾间质纤维化是LN发展到终末期的表现，是SLE最常见死亡原因。多项研究认为，LN肾组织内大量氧自由基通过多种途径造成肾组织损害，这种损害和患者机体GSH降低有关［2］。研究认为LN肾组织TGF-β1过度表达导致了肾间质纤维化。研究表明小鼠胚胎成纤维细胞GSH可以阻断TGF-β1引起的纤溶酶原激活物抑制物-1mRNA的表达，促进细胞外基质降解；狼疮患者体内GSH水平下降，是机体内氧化-抗氧化失衡的主要原因，其降低水平和疾病活动有相关性［4］，这个结论与本项研究中GSH合成限速酶γ-GCS表达降低（P＜0.05）的结果是一致的。γ-GCS的mRNA表达降低，必然导致GSH水平降低。因此认为，SLE患者体内GSH降低是消耗增加和产生减少共同导致的。目前考虑炎症损伤及免疫学损害使肾组织GSH消耗并γ-GCS表达减少，氧化损害加剧导致纤维化因子TGF-β1过度表达，肾间质纤维化。

综上，GSH在狼疮性肾炎发展到纤维化过程中有重要作用［5］，本研究认为γ-GCS在MRL/1pr小鼠肾组织表达减少可能是导致肾组织GSH降低的根本原因，也是LN肾组织氧化应激加重的重要原因，外源性补充GSH或增强表达γ-GCS可从根本上提高肾组织GSH水平，可能减缓肾间质纤维化进程。

参考文献

［1］Kurien BT，Scofield RH.Free radical mediated peroxidative damage in systemic lupus erythematosus［J］.Life Sci，2003，73 （13）：1655-1666.

［2］廖永强，夏洪娇，彭可君，等.氧化还原态改变和淋巴细胞凋亡与系统性红斑狼疮疾病活动度的相关性研究［J］.中国免疫学杂志，2013，29（12）：1288-1292.

［3］许鸣华，李振彬，孙彩霞，等.雷公藤多苷对狼疮小鼠肾组织高迁移率族蛋白-1及转化生长因子-β1表达的影响［J］.中华临床免疫和变态反应杂志，2015，9（3）：187-193.

［4］逯惠敏，胡晓蕾，蒋红梅，等.系统性红斑狼疮患者的氧化应激状态分析［J］.山东医药，2010，50（9）：60-61.

［5］齐亚军，刘健，曹云祥，等.风湿病的氧化应激及干预研究进展［J］.中华中医药学刊，2013，31（12）：2606-2609.

中图分类号：R593.24+2

文献标识码：B

文章编号：1672-8351（2016）07-0133-01