高产D-核糖菌株选育

任柯 张志刚崔凤霞

（1.郑州市第十九中学 河南郑州 450001 2.郑州拓洋实业有限公司技术中心 河南郑州 450066）

高产D-核糖菌株选育

任柯1张志刚1崔凤霞2

（1.郑州市第十九中学 河南郑州 450001 2.郑州拓洋实业有限公司技术中心 河南郑州 450066）

以枯草芽孢杆菌转酮醇酶变异株为出发菌株，运用物理和化学相结合的方法进行复合诱变，将出发菌株在紫外灯下照射后加入硫酸二乙酯置于摇床上诱变，再加入硫代硫酸钠终止反应。选出多个诱变后菌株，进行初筛和复筛，反复几次，以未经处理的菌株做对照，对突变株进行多次传代和D-核糖发酵试验，选育出D-核糖高产突变株。

D-核糖；复合诱变；高产菌株；选育；发酵

D-核糖（D-Ribose，D-R）是一种五碳糖，是目前合成维生素B2的重要原料，也可用于合成抗病毒、抗肿瘤的药物[1]。可以转化为核糖核苷酸和核黄素，应用于制药、医药、化妆品、健康食品以及动物饲料等方面。近年来发现，D-核糖能提高心脏对局部缺血的耐性，改善心肌功能、有效缓解运动后引起的肌肉疼痛，是新兴的医药保健品，目前在欧美日本等发达国家已经流行，市场需求上升较快。D-核糖还可作为天然的食品甜味剂，所含热量低且不会引起血糖升高，是肥胖病人、糖尿病人理想的甜味替代品。从未来发展趋势看，随着核酸药物的发展和D-核糖功能作用的认知，D-核糖将作为保健食品被广泛使用，其市场将在今后较长时期内持续增长。国内外D-核糖生产厂家普遍采用生物发酵法，是以葡萄糖为原料，利用微生物发酵生产，具有成本低、易于大规模生产、环境污染小等优点[2]。D-核糖在我国发酵工业中是一新兴的发酵产品，随着D-核糖产品及其衍生物应用范围不断扩展、延伸，新产品的持续开发和市场需求的发展，获得高产D-核糖的菌种已成为微生物领域研究热点。国内在D-核糖发酵方面的研究进展迅速，但与国外还有一些差距，存在菌种易退化、发酵产率较低、成本较高等问题。因此，本项目主要研究适合我国发酵企业自身条件和特点的高产D-核糖菌种技术，以达到充分挖掘引进高产菌株的潜力，进一步提高产能，缩短发酵周期，降低生产成本的目的，本文报道了此项研究结果。

1 试验材料与方法

1.1 材料与仪器

（1）供试菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）转酮醇酶（Transketolase）变异株，郑州拓洋实业有限公司技术中心保存。

（2）仪器：高速冷冻离心机、真空干燥箱、台式恒温振荡器、紫外可见分光光度计、电热恒温培养箱、电磁搅拌器、酸度计、100ml带盖玻璃瓶（耐冷耐热）、生物传感仪、超低温冰箱、超净工作台、高压灭菌器等。

1.2 培养基

（1）基本培养基（g/L）：葡萄糖 15.0，硫酸铵 2.0，硫酸镁 0.5，磷酸氢二钾2.0，磷酸二氢钾2.0，玉米浆2.0，琼脂30.0，pH值7.0～7.2。

（2）补充培养基：在基本培养基中添加0.3g/L莽草酸。

（3）完全培养基（g/L）：葡萄糖 15.0，牛肉膏 20.0，蛋白胨 5.0，酵母膏 2.0，琼脂 30.0，pH 值 7.0～7.2。

（4）种子培养基（g/L）：葡萄糖 20.0，玉米浆 10.0，酵母膏 4.0，蛋白胨10.0，磷酸氢二钾2.0，磷酸二氢钾1.0，pH值7.2～7.5。

（5）发酵培养基（g/L）：葡萄糖 90.0，葡萄酸钙 50.0，玉米浆20.0，硫酸铵 2.0，硫酸锰 0.2，酵母粉 3.0，硫酸镁 0.4，pH 值 7.2～7.5。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种诱变处理

将保存的菌种接到完全培养基斜面上，40℃培养30h后，冰箱冷藏30h。将20ml无菌生理盐水倒人试管内收集菌悬液，转入250ml三角瓶中，并加入玻璃珠在200r/min的旋转摇床上振荡打散细胞，制成单细胞菌悬液冷藏备用。

1.3.2 紫外诱变

取1ml菌悬液用生理盐水按梯度稀释法[3]稀释到10-9数量级，在直径45mm的培养皿中加入5ml单细胞悬浮液，放入暗箱并用电磁搅拌器进行搅拌，在50W紫外灯下距离15cm照射（紫外灯先预热30min，使其波长稳定），不同处理时间（60s，90s，120s），黑暗中静置10h备用。

1.3.3 硫酸二乙酯（D ES）诱变

将5ml经过紫外诱变处理的菌悬液加入到20ml磷酸盐缓冲液中，再加入1%的DES，40℃置于150r/min的摇床上诱变处理30min，加入硫代硫酸钠终止反应。

1.3.4 菌株初筛

将在完全培养基上生长，在基本培养基上不生长，却能在补充培养基上生长的菌落作为初筛对象转接于装有完全培养基的试管斜面上，40℃培养60～72h后挑选生长好的作为复筛对象冷藏备用。

1.3.5 菌种定向复筛

对初筛选出的菌株进行摇瓶发酵，多次筛选并测定D-核糖的产量。

1.3.6 菌株产D-核糖的能力试验

种子培养：种子培养基的装液量为250ml三角瓶50ml，摇床，40℃培养25h。发酵培养：发酵培养基的装液量为500ml三角瓶60ml，接种量5%，摇床40℃发酵72h。将诱变后的菌株连续传代10次后，测定其遗传稳定性和产D-核糖能力。

1.4 测定方法

菌体OD值测定：将菌液稀释10倍，紫外可见分光光度计于波长650nm处测定光密度[4]。pH值测定：用pH计测定。D-核糖含量测定：用苔黑酚法测定[5]。

2 结果与分析

2.1 细胞形态变化观察

在发酵过程中，高产突变株的细胞形态发生变化，前期菌体个体形态小，呈单个细杆状，分裂末端呈圆形。中、后期菌体形成链状、锁状及数字状，形如霉菌菌丝体，并且菌体形态粗壮，但到发酵结束后，菌体又恢复呈单个杆菌状。而原出发菌株前期末端呈平头状，菌体形态粗短，中、后期成链状，分隔明显。

2.2 高产菌种遗传稳定性试验

经反复多次诱变筛选最终从出发株得到突变株。为了考察高产菌种的遗传稳定性，将突变菌株连续传代10次后，测定其遗传稳定性和产D-核糖能力，结果见表1。

表1 菌种的遗传稳定性

由表1可知，10代D-核糖产量在109.6g/L，仍维持在较高的发酵水平，平均D-核糖产糖量在110.3g/L，没有发生显著变化，说明高产突变菌株具有良好的遗传稳定性，这是一个稳定的突变株。

2.3 发酵过程的各项指标对照

对供试菌株和高产突变菌株各做了10批发酵实验，结果见表2。

从表2中两组数据可以看出，高产突变菌株平均单次D-核糖含量为110.3g/L，平均转化率66.3%；供试菌株平均单次D-核糖含量为75.1g/L，平均转化率45.6%，前者比后者分别多出35.2g/L和20.7%，效果是极其显著的。

表2 变异菌株的发酵产糖量及转化率

3 结论

供试菌种经紫外和化学诱变处理后，通过选育具有莽草酸缺陷的突变株，获得了产物积累能力较高的D-核糖生产菌株。与原出发菌株相比，该菌株使发酵液pH稳定在5.5～6.8之间，能使D-核糖单批含量大大提高（平均为110.3g/L），平均提高35.2g/L，增幅达46.90%，发酵转化率增幅达45.4%。而且该突变株具有稳定的遗传性，经10代传种后遗传性无明显变化，产量稳定，具有典型的缺失转酮酶突变株的生长特点，具有很大的生产潜力。

在此，特别感谢辅导老师张志刚的鼎力帮助，谢谢张老师的指导！

[1]邱蔚然，高淑红.发酵法生产 D-核糖[J].工业微生物，2003，30（1）：58～64.

[2]Sasajima K，Yoneda M.Carbohydrate metabolism-mutants of a Bacillus species part II.D-ribose accumulation by pentose phosphate pathway mutants[J].Agr Biol Chem，1971，35（4）：509～517.

[3]范秀容，沈 萍.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，1988：102.

[4]任蓓蕾，史小莉，闫世梁，等.D-核糖产生菌抗噬菌体菌株的选育[J].中国新技术新产品，2011，197（07）：14～15.

[5]彭其安，张西峰，吴思方，等.同源重组法构建枯草芽孢杆菌转酮酶缺失突变菌株[J].生物技术，2006，16（6）：23～16.

张志刚，男，高级教师，从事生物方面的研究。

Q939.99

A

1005-7897（2016）04-0118-02

2016-2-10

任柯（1999-），女，河南郑州人，高中生，对微生物比较感兴趣，根据暑期社会实践科技创新活动工作整理。