辽宁地区貂源铜绿假单胞菌分离鉴定与药敏试验

屈腾飞，张小桐，曹嫚嫚，周铁忠，柴文戌，屈禹城，王春华，陈磊，米成军，王辉暖⋆

辽宁地区貂源铜绿假单胞菌分离鉴定与药敏试验

屈腾飞1，张小桐1，曹嫚嫚1，周铁忠1，柴文戌2，屈禹城1，王春华1，陈磊3，米成军4，王辉暖1⋆

（1.锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁锦州121001；2.锦州医科大学第一附属医院。辽宁锦州121001；3.辽宁省兴城市药王动物卫生监督所，辽宁兴城125127；4.山东省临沂市兰山区畜牧兽医局，山东临沂267004）

为了解辽宁地区水貂铜绿假单胞菌的流行状况及耐药情况，对从辽宁地区暴发出血性肺炎养貂场分离的16株分离菌进行了分离纯化、生化鉴定、基因鉴定、血清学分型和药敏试验。结果显示，分离株包括G型和B型两种血清型，其中G型是主要流行血清型，占分离株的75%，其余是B型。分离株对阿米卡星、头孢呋肟、阿莫西林和亚胺培南的敏感率较高，对氨苄青霉素的敏感率中等，对氯霉素、氨曲南和左氟沙星具有一定的耐药性。

水貂；铜绿假单胞菌；分离；鉴定；药敏试验；血清型

水貂出血性肺炎又称水貂假单胞菌肺炎，是由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA），俗称绿脓杆菌引起的急性、败血性传染病，是一类人畜共患的条件致病菌，在水貂以出血性肺炎为主要特征，发病急，死亡快，常呈地方性暴发流行，给养貂业造成巨大经济损失[1]，该病自1953年丹麦的Knox首次报道以来[2]，相继在瑞典、芬兰、美国、法国和日本被报道，1979年我国的刘凯[3]对该病做了首次报道，随后在国内陆续出现[4-5]。近几年随着养貂业快速发展，养殖密度增加，尤其是在炎热潮湿的夏秋季节，水貂出血性肺炎已呈暴发性流行，成为严重危害水貂养殖的重要传染病。由于引起水貂出血性肺炎的铜绿假单胞菌血清型较多，并且不同血清型之间几乎没有交叉感染保护或者交叉保护力低，同时铜绿假单胞菌又具有极强的耐药性[6]，而目前国内缺少正式上市的水貂出血性肺炎疫苗，因此本研究对采自辽宁各地的水貂出血性肺炎的病料进行分离、基因鉴定、血清学分型并进行了耐药试验，以了解辽宁省水貂铜绿假单胞菌的流行特点、耐药性，为临床治疗和研制疫苗预防该病提供理论依据和参考。

1 材料和方法

1.1 病料和菌株采集2013～2014年辽宁省大连市、盘锦市、营口市、锦州市、葫芦岛市等地暴发出血性肺炎貂场的病貂，铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27583本实验室保存。

1.2 主要试剂十六烷三甲基溴化胺琼脂培养基（NAC）（购自北京陆桥技术有限责任公司）、药敏试纸（购自杭州天和微生物试剂有限责任公司）、2×PCR TaqMix、DNA提取试剂盒、胶回收与纯化试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司）、绿脓杆菌血清分型用标准阳性血清（日本生研株式会社）。

1.3 细菌分离纯化无菌条件下打开病貂的肺脏接种于NAC琼脂培养基，37℃培养16～24 h，待长出单个菌落，进行革兰氏染色和菌落形态观察，同时挑取单菌落进行连续纯化培养，直到显微镜检查为单一细菌，将纯培养物接种于LB琼脂糖培养管进行增菌备用，同时接种于NAC琼脂平板观察培养特性。

1.4 基因鉴定取1.5 mL菌液按照试剂盒的说明提取分离菌株的DNA，以细菌的16S rRNA为目标基因进行PCR鉴定，引物采用27F和1 492 r通用引物，见表1[7]，反应体系为30μL，其中PCR模板2μL，2×PCR TaqMix 15μL，上下游引物各1μL，去离子水10μL；PCR反应条件：94℃5 min，30个循环，94℃45 s，55℃45 s，72℃45 s，72℃10 min，4℃保存。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，然后凝胶成像系统分析结果。结果为目的片段后，胶回收纯化PCR产物并送上海生工生物技术有限公司序列测定，序列利用Blast与已知序列进行对比，确定所分离菌株的种属。

1.5 血清型鉴定根据参考文献[8]的方法进行操作。

1.6 药敏试验按照CLSI 2009版铜绿假单胞菌K-B法标准操作程序和判断标准进行。

2 结果和分析

2.1 细菌分离纯化共分离得到16份菌株，全部能够在NAC培养基上生长良好，菌落呈圆形、微隆起、扁平、湿润、大小不一，有水溶性绿色或褐色色素产生，革兰氏染色为阴性两端钝圆的短杆菌，单个或者成双排列。

2.2 基因鉴定将PCR产物凝胶电泳后，在1 500 bp附近可见清晰的目的条带（见图1），胶回收后对PCR产物测序，16株分离株16S rRNA片段长度1 438 bp左右。在NCBI上通过Blast对序列对比，发现分离株序列与铜绿假单胞菌的同源性到达99%，同源性达到97%以上视为同种水平，因此，进一步确认分离的菌株为铜绿假单胞菌属的铜绿假单胞菌。

2.3 血清型鉴定经玻板凝集试验鉴定，16株铜绿假单胞菌的血清型见表2，可见在辽宁地区G型和B型是水貂铜绿假单胞菌的主要流行菌株，其中G型占的比例最高，达到75%，；其次是B型占25%，其余血清型未检出。

图1 16株分离菌株PCR扩增结果Fig.1 PCR result of 16 isolated strains

表2 16株铜绿假单胞菌血清型鉴定结果Table2 Serotyping result of 16 strains

2.4 药敏试验铜绿假单胞菌分离菌株的药敏试验结果见表3，可见分离株对阿米卡星、头孢呋肟、阿莫西林和亚胺培南四种药物的敏感率较高，分别为88%、75%、69%和66%，而耐药性较低。对氨苄青霉素的敏感率中等，而对氯霉素、左氟沙星和氨曲南具有一定的耐药性，其中对氯霉素的耐药性最高达到75%，其余两种的耐药性为44%和50%。

3 讨论

本试验通过铜绿假单胞菌选择培养基和16S rRNA的基因鉴定，确认从多个水貂出血性肺炎的肺脏中分离的菌株为铜绿假单胞菌，表明铜绿假单胞菌是导致水貂暴发出血性肺炎的重要病原菌之一。随着水貂出血性肺炎的频繁暴发，以及对养貂业造成的危害程度，需要获得该病原菌的病原学、流行病学详细资料，以期能够提出有效的防治策略，保障水貂养殖业的健康发展，而目前对铜绿假单胞菌主要针对的是人源铜绿假单胞菌的研究，尤其是人源铜绿假单胞菌耐药机理的研究，而对貂源铜绿假单胞菌的研究资料相对较少，因此开展更多貂源铜绿假单胞菌的相关研究工作很有必要。

表3 16株铜绿假单胞菌药敏试验结果Table3 Results on drug sensitivity test of 16 strains

本次血清型的鉴定结果与闫新武等[9]报道的相同，与其他学者报道的基本相同，只是比例稍有差异外，以及他们还鉴定出少量的其他血清型，比如I型[8，10-12]、C型[6，12-13]、E型[6]、D型和F型[12]，但都以G型为主要血清型，由于不同血清之间没有交叉保护或者交叉保护力低[6]，这就需要研制能够包含所有血清型的疫苗才能起到很好的保护作用。

铜绿假单胞菌的耐药机制比较复杂，主要包括青霉素结合蛋白的突变、外膜蛋白缺乏、产生钝化酶以及泵的主动外排等，其耐药性受多个系统参与调控。本次的药敏试验结果表明，由于分离株对氨苄青霉素（6%）、氯霉素（6%）、左氟沙星（19%）和氨曲南（6%）的敏感率低于20%，因此不建议在临床上使用这些药物治疗铜绿假单胞菌的感染。而在抗铜绿假单胞菌的药物中抗菌活性最高的是阿米卡星，这也是本次药敏试验中唯一一个敏感率超过80%的药物（88%），潘德芹[14]对2010年3月～2014年2月118株临床分离的貂源铜绿假单胞菌药敏试验显示阿米卡星的敏感率为72%，白雪等[8]检测2002～2010年间从国内5个省水貂养殖场暴发出血性肺炎的水貂肺中分离获得45株绿脓杆菌对阿米卡星的敏感率为78%，其他学者的检测结果也表明貂源铜绿假单胞菌对阿米卡星是敏感的，耐药率低[9，15-16]，该结果与人源铜绿假单胞菌耐药性试验的调查相同。陈越等[17]对2012年中国不同地区7 270株铜绿假单胞菌临床分离株的耐药性调查显示，在检测的12种临床常用抗菌药物中铜绿假单胞菌对阿米卡星的耐药率最低，为13.5%，同时也是敏感率最高的药物达到82.3%，而随后张祎博等[18]对国内19家医院2005～2014年临床分离的铜绿假单胞菌耐药性调查显示10年间铜绿假单胞菌对阿米卡星敏感率一直是最高的，原因可能是铜绿假单胞菌对氨基糖苷类修饰酶介导的耐药存在底物特异性，高度耐药较少；同时临床上该类药物较其他类抗菌药物少。但孙娜等[19]对山东某貂场分离的5株铜绿假单胞菌药敏分析发现该菌对阿米卡星耐药，这是新的耐药趋势还是其他原因引起的值得进一步的研究。由于铜绿假单胞菌的耐药性高，耐药机制复杂，使用单一抗菌药物治疗易产生耐药，因此建议在临床上治疗铜绿假单胞菌引起的疾病，一方面坚持联合用药、规范用药，另一方面应加强细菌耐药监测，根据试验结果及时调整合适的抗菌药物。

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Identification and Drug Sensitivity Testof Pseudomonas Aeruginosa from Mink

Qu Tengfei1,Zhang Xiaotong1,Cao Manman1,Zhou Tiezhong1,Chai Wenxu2, Qu Yucheng1,Wang Chunhua1,Chen Lei3,Mi Chengjun4,Wang Huinuan1*
(1.College of Animal Husbandry&Veterinary,Jinzhou Medical University,Liaoning Jinzhou 121001; 2.The First Affiliated Hospital,Jinzhou Medical University,Liaoning Jinzhou 121001; 3.Xingcheng Animal Health Supervision Institute,Liaoning Xingcheng 125127; 4.Lanshan of Linyi City Animal Husbandry&Veterinary Bureau,Shandong Linyi 267004)

To investigate the epidemic characteristics and drug resistance of pseudomonas aeruginosa(PA)from minks in Liaoning province,16 bacterial isolated from minks with hemorrhagic pneumonia were identified and characterized by biochemical test,gene,serotypes and drug sensitivity test.Result showed that all 16 isolates were identified as PA by biochemical test and gene.Serogroup G and serogroup B were identified in all isolated strains.Serogroup G was the major serotype,75%of the isolates,The rest is serogroup B.Isolates were high sensitive to amikacin,cefuroxime,amoxicillin and imipenem,moderate sensitivity to ampicillin,and has high resistance to chloramphenicol,aztreonam and levofloxacin.This showed that pseudomonas aeruginosa from mink were multidrug resistance.

Mink;Pseudomonas aeruginosa;Separation;Identification;Drug sensitivity test; Serotype

S852.61

B

1672-9692(2016)11-0001-04

2016-09-15

屈腾飞（1994-），男，河南周口人，本科在读，从事动植物检疫工作。

王辉暖（1974-），男，山东威海人，博士，讲师。

2014年省级大学生创新创业训练计划项目（201410160036）、辽宁省自然科学基金（2015020779）。