硫化氢在骨巨细胞瘤中的检测及其在病情评估中的意义*

胡杨 胡丹雄 廉凯* 覃威 晏雄伟

论著·临床研究

硫化氢在骨巨细胞瘤中的检测及其在病情评估中的意义*

胡杨1胡丹雄2廉凯1* 覃威1晏雄伟1

目的检测骨巨细胞瘤组织硫化氢浓度并研究其临床意义。方法检测骨巨细胞瘤患者肿瘤组织和瘤旁正常组织硫化氢、胱硫醚合成酶（Cystathionine beta synthase,CBS）和胱硫醚裂解酶（Cystathionine gamma synthase,CSE）表达并比较其差异，分析骨巨细胞瘤患者硫化氢浓度与临床病理因素的关系。结果骨巨细胞瘤组织中硫化氢浓度、CBS和CSE的mRNA和蛋白质表达均显著高于瘤旁正常组织骨巨细胞瘤患者肿瘤组织中硫化氢浓度在性别、年龄和肿瘤部位中无明显差异（均，在肿瘤最大径、Jaffe分级和Campanacci分级中差异均具有统计学意义（均肿瘤最大径越大、Jaffe分级越高及Campanacci分级越高硫化氢浓度越高。结论骨巨细胞瘤中硫化氢浓度显著升高，与临床病理因素密切相关，可能在骨巨细胞瘤病情评估中具有重要意义。

骨巨细胞瘤；硫化氢；病情

骨巨细胞瘤多侵犯四肢长骨末端，约50%发生在膝关节周围，侵袭破坏力大，易局部复发，故寻找病情及预后评估的标志物对骨巨细胞瘤的诊断与治疗具有重要意义[1,2]。硫化氢是人体内第3种气体信号分子，由胱硫醚合成酶（CBS）以及胱硫醚裂解酶（CSE）催化L-半胱氨酸而生成，大量研究表明硫化氢在肿瘤和炎症的发生发展中具有重要作用[3,4]，但目前在硫化氢及其合成酶CBS和CSE与骨巨细胞瘤的关系方面尚无相关研究。本研究检测骨巨细胞瘤患者硫化氢、CBS和CSE表达，研究硫化氢在骨巨细胞瘤病情评估中的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2013年1月～2015年6月本科诊治的骨巨细胞瘤患者为研究对象，纳入标准：首次就诊，既往未行手术、放疗或化疗等治疗；均经X线、CT、MRI和术后病理组织学检查确诊；排除合并其他肿瘤等。本研究共纳入32例骨巨细胞瘤患者，包括男15例，女17例；年龄20～50岁，平均年龄（36.8±4.5）岁。本组患者均取骨巨细胞瘤组织及对应瘤旁正常组织做后续检测。

1.2 硫化氢检测

采用敏感硫电极法检测骨巨细胞瘤组织和瘤旁正常组织硫化氢含量。采用敏感硫电极测定溶液中S2-，间接反映硫化氢的浓度。取骨巨细胞瘤组织和瘤旁正常组织加入反应瓶，加入0.5mLHCl（1mol/L），使组织硫化氢释放，反应瓶中小烧杯内加入0.5mLNaOH（1mol/L），以吸收硫化氢，用双层石蜡膜迅速封口。将反应瓶置于37℃水浴箱孵育4小时。取出小烧杯内液体，加入0.5 mL抗氧化液。采用酸度计测定溶液中的电压值。使用标准S2-溶液用抗氧化液稀释成1、10、20、40、80、100 mol/L溶液做标准曲线计算S2-浓度，S2-间接反映硫化氢的浓度。

1.3 CBS和CSE的mRNA表达检测

根据蛋白质提取试剂盒操作说明提取巨细胞瘤组织和瘤旁正常组织总RNA，采用RT-PCR检测CBS和CSE的mRNA表达，以GAPDH为对照，引物序列见表1，PCR后的产物采用凝胶电泳后显像检测。

表1 RT-PCR检测CBS和CSE的mRNA表达引物序列

1.4 CBS和CSE蛋白质表达检测

采用Western blot检测CBS和CSE蛋白质表达，以每孔20g的上样量行聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，湿法转膜至PVDF膜，脱脂牛奶封闭1小时后，以兔抗CBS和CSE一抗4°C孵育过夜，TBST（10 min×3次）漂洗，以辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2小时，TBST洗膜，ECL显影，以-actin为内参拍照分析。

1.5 数据分析

采用SPSS12.0进行统计学分析。骨巨细胞瘤组织和瘤旁正常组织硫化氢浓度、CBS和CSE的mRNA和蛋白质表达对比采用检验。不同临床病理因素中硫化氢浓度对比采用检验。认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 骨巨细胞瘤组织和瘤旁正常组织硫化氢对比

骨巨细胞瘤组织中硫化氢浓度为（0.63±0.11）nmol/mg，瘤旁正常组织中硫氢浓度为（0.12±0.01）nmol/mg，骨巨细胞瘤组织中硫化氢浓度显著高于瘤旁正常组织（图1）。

图1 骨巨细胞瘤组织和瘤旁正常组织硫化氢浓度对比

2.2 骨巨细胞瘤组织和瘤旁正常组织CBS和CSE的mRNA对比

骨巨细胞瘤组织中CBS和CSE的mRNA表达水平均显著高于瘤旁正常组织（均，具体结果见图2和图3。

图2 骨巨细胞瘤组织和瘤旁正常组织CBS的mRNA对比

图3 骨巨细胞瘤组织和瘤旁正常组织CSE的mRNA对比

2.3 骨巨细胞瘤组织和瘤旁正常组织CBS和CSE蛋白质对比

骨巨细胞瘤组织中CBS和CSE蛋白质表达水平均显著高于瘤旁正常组织（均具体结果见图4和图5。

图4 骨巨细胞瘤组织和瘤旁正常组织CBS蛋白质表达对比

图5 骨巨细胞瘤组织和瘤旁正常组织CBS蛋白质表达对比

2.4 硫化氢与临床病理因素的关系

比较本组骨巨细胞瘤患者肿瘤组织中硫化氢在不同临床病理因素中的差异，硫化氢浓度在性别、年龄和肿瘤部位中无明显差异（均，在肿瘤最大径、Jaffe分级和Campanacci分级中差异均具有统计学意义（均，肿瘤最大径越大、Jaffe分级越高及Campanacci分级越高硫化氢浓度越高（表1）。

3 讨论

骨巨细胞瘤具有潜在的侵袭性恶变，术后复发率高，加上其对放化疗治疗不敏感，导致目前骨巨细胞瘤的疗效及预后较差，故寻找能早期诊断骨巨细胞瘤对病情评估具有决定意义。骨巨细胞瘤的发病机制尚未完全明确，随着快速杂交及实时定量聚合酶链式反应等技术在骨巨细胞瘤中的应用，基因突变、基因表达谱及信号通路等基因组学实践被认为参与骨巨细胞瘤的发生、发展及转归，其中信号传导通路的异常被认为是骨巨细胞瘤最主要的发病机制[5,6]。硫化氢作为人体内第3种气体信号分子，体内由CBS及CSE催化L-半胱氨酸而生成，大量研究表明一碳单位以及含巯基物质广泛参与含巯基物质代谢以及药物转化，而硫化氢合成途径位于一碳单位与转硫途径的关键位置，广泛参与-SH与-SS-的代谢循环，并且其终末产物正是体内最重要的还原性物质谷胱甘肽。研究表明，硫化氢具有促进血管新生的作用，肿瘤细胞通过促进CBS和CSE的合成而增加硫化氢的合成，最终促进肿瘤细胞的增殖[7]，而有些体外实验则表明硫化氢具有抑制肿瘤细胞增殖和侵袭及诱导凋亡等功能[8,9]。基于这些证据，推测硫化氢可能与骨巨细胞瘤的发病机制存在关联，本研究中，骨巨细胞瘤的肿瘤组织的硫化氢浓度、CBS和CSE的mRNA和蛋白质表达均显著高于瘤旁正常组织，证实硫化氢与骨巨细胞瘤的关系。

表1 不同临床病理因素中硫化氢浓度差异对比

表1 不同临床病理因素中硫化氢浓度差异对比

目前评估骨巨细胞瘤的病情的指标包括Jaffe分级和Campanacci分级，前者为病理学分级，分级越高表示恶性程度越大；后者为影像学分级，分级越高表示病情越重，预后越差。Jaffe分级无法在术前提供客观科学证据，而Campanacci分级多受影像学检测仪器及阅片人员主观影响，均无法提供准确的病情评估证据，故分子水平的标志物可能较传统的Jaffe分级和Campanacci分级更能反映病情。研究发现，内源性硫化氢及其合成酶CBS和CSE在膀胱癌组织中表达水平显著高于正常组织，进一步发现其与膀胱癌的分期和分级紧密相关，表明其可用于评估膀胱癌的病情及预后[10]。本研究中，比较本组骨巨细胞瘤患者肿瘤组织中硫化氢在不同临床病理因素中的差异，发现硫化氢浓度在性别、年龄和肿瘤部位中无明显差异（均在肿瘤最大径、Jaffe分级和Campanacci分级中差异均具有统计学意义（均肿瘤最大径越大、Jaffe分级越高及Campanacci分级越高硫化氢浓度越高，这些证据表明硫化氢可能在骨巨细胞瘤病情评估中具有重要意义。新型气体信号分子硫化氢的研究在国际上也尚处于起步阶段，在骨巨细胞瘤方面更是空白，故本实验意义重大，可能为骨巨细胞瘤的发病机制及诊断治疗探索提供新的研究方向。

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Expression of hydrogen sulfide in patients with giant cell tumor of bone and value in evaluation of disease condition

Hu Yang1,Hu Danxiong2,Lian Kai1,et al.1 Department of Orthopedics,Xiangyang Central Hospital,Affiliated to Hu Bei University of Arts and Science,Xiangyang Hubei,441021;2 Xiaohe Township Hospital,Xiangyang Hubei, 441021,China

Objective To detect the hydrogen sulfide in patients with giant cell tumor of bone and study its value in evaluation of disease condition.Methods Hydrogen sulfide,cystathionine gamma synthaseandcystathionine gamma synthase expressions in patients with giant cell tumor of bone were detected and compared.The differences of hydrogen sulfide in different clinicopathological factors were compared.Results The hydrogen sulfide,cystathionine gamma synthase and cystathionine gamma synthase expressions in tumor tissues were significantly higher than in adjacent normal tissues.The differences of hydrogen sulfide in tumor diameter,Jaffe staging and Campanacci staging were statistics significantConclusion The hydrogen sulfide in patients with giant cell tumor of bone is significantly high and correlates with clinicopathological factors,which may play an important role in disease condition evaluation of disease condition.

Giant cell tumor of bone;Hydrogen sulfide;disease condition;

R738.1

B

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.05.008

swgk2016-03-00044

胡杨（1983-）男，硕士，主治医师。研究方向：骨科。

*[通讯作者]廉凯（1968-）男，博士，主任医师。研究方向：骨科。

2016-03-07）

湖北省卫生厅一般项目（JX6B36）

1湖北文理学院附属医院骨科（襄阳市中心医院），湖北襄阳441021；2湖北襄阳宜城市小河卫生院，湖北襄阳441201