不同分子量γ—聚谷氨酸对绿豆萌发及幼苗的影响

郝荣华++张晓元++刘飞++朱希强++凌沛学+王桂兰

摘要：以绿豆为材料，采用一定浓度不同分子量的γ-聚谷氨酸对绿豆种子进行处理，研究了不同分子量的γ-聚谷氨酸对绿豆种子萌发及幼苗生长的影响。结果表明：不同分子量的γ-聚谷氨酸能够不同程度地提高种子的发芽率，增加幼苗的株高、根长、鲜质量等生理指标，相应地，种子的淀粉酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性也有不同程度的提高。其中相对分子质量为120 ku的γ-聚谷氨酸处理种子的效果最好。

关键词：聚谷氨酸；绿豆；相对分子质量；生理指标；酶活性

中图分类号： S184；S522.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0169-03

收稿日期：2015-02-15

基金项目：山东省自主创新成果转化专项（编号：2014GGZH1306）；山东省济南市自主创新产业化重大专项（编号：201403009）。

作者简介：郝荣华（1983—），女，山东泰安人，博士，助理研究员，主要从事基因工程药物研究。Tel：（0531）81213080；E-mail：ronghua34@163.com。

通信作者：朱希强，博士，研究员，主要从事生物技术药物研究。Tel：（0531）81213080；E-mail：xistrong@sina.com。γ-聚谷氨酸是一种水溶性的可生物降解的高分子聚合物，最早于1937年由Lvanovics等人从炭疽芽孢杆菌的荚膜中发现的[1]，随后Bovarnick的研究发现有些芽孢杆菌属细菌在胞外积累可以获得γ-聚谷氨酸[2]。近年来，国内外对γ-聚谷氨酸的微生物发酵的研究也越来越多，采用不同菌株和不同发酵工艺生产的γ-聚谷氨酸分子量也会不同，其分子量大约为10～2 000 ku。 γ-聚谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸以α-胺基和γ-羧基之间经酰胺键聚合而成，其结构式如图1。

γ-聚谷氨酸具有极佳的成膜性、可塑性、黏结性、保湿性和可生物降解等独特的理化和生物学特性，具有保鲜、增稠、乳化、凝胶、保湿等功效，是一种对人和环境无毒害的新型天然高分子，因此被广泛应用于农业、化妆品、制药等领域[3]。在医药领域，γ-聚谷氨酸可以作为药物的缓释、靶向载体及外科手术的黏胶剂、止血剂和密封剂等[4-5]，这是由于γ-聚谷氨酸作为生物降解型高分子，其降解产物能通过正常的新陈代谢或被机体吸收利用或被排出体外。在化妆品工业领域，γ-聚谷氨酸高保湿性能使得其用于提升皮肤水分的保水量，有效减少水分散失，增强皮肤弹性。另外，聚谷氨酸还可抑制体内酪氨酸酶活性，从而抑制皮肤黑色素的生成，具有皮肤美白效果[6-8]。在农业领域，γ-聚谷氨酸良好的生物可降解性和高吸水性已被开发应用于植物种子的包衣材料，增强土壤的吸水性，从而使沙漠及缺水干旱地区的绿化及固沙有了可靠的保障[9]。另外，γ-聚谷氨酸还可作为土壤的增肥剂，促进作物吸收养分，减少肥料使用，增加作物产量，改良作物品质，提高作物的抗病能力[10-13] 。同时，γ-聚谷氨酸在土壤中具有很强的保水性，是种子萌发的促进剂，有明显的抗旱促苗效应，可以有效地提高作物的发芽率和种子活力[14-15] 。γ-聚谷氨酸的成膜性还可以作为保鲜剂用来延长鲜花和蔬菜的保鲜时间[16]。这些研究都充分展示了聚谷氨酸在农业应用领域的巨大潜质，使其在农业领域有着广泛的应用前景，在农业领域将发挥更重要的作用。综合γ-聚谷氨酸在农业领域中的应用及研究成果，γ-聚谷氨酸对植物的抗旱促苗效应已有报道，但不同分子量的γ-聚谷氨酸对植物种子的萌发及幼苗生长是否具有不同作用还未得到深入研究。本试验采用不同分子量的γ-聚谷氨酸处理绿豆种子，研究其对绿豆种子萌发及幼苗生长的影响。

1材料和方法

1.1材料

以市售绿豆种子为试验材料，γ-聚谷氨酸（分子量分别为10、70、120、1 200、2 000 ku），山东福瑞达生物科技有限公司生产。

1.2方法

1.2.1种子萌发试验选择籽粒饱满、大小均匀一致、完好无损的绿豆种子，用γ-聚谷氨酸溶液浸种6 h，然后将种子摆放在直径为15 cm培养皿中，每个培养皿放置400粒种子，种脐向下，分别加入20 mL相应的γ-聚谷氨酸溶液，各设置3次重复。γ-聚谷氨酸质量分数设为0.02%，γ-聚谷氨酸相对分子质量分别为0、10、70、120、1 200、2 000 ku。种子在室温（温度为28±1 ℃）下萌发。

1.2.2指标测定种子萌发指标的计算公式如下：

发芽势=发芽初期（前5 d）发芽种子数/供试种子数×100%；

发芽率=发芽终期（前8 d）发芽种子数/供试种子数×100%。

种子萌发试验结束后，从每个处理中分别随机取10株幼苗，测量其株高、根长、地上部分鲜质量、地下部分鲜质量。种子萌发的1～2 d测定淀粉酶、过氧化氢酶及过氧化物酶活性，分别采用DNS法、愈创木酚法及高锰酸钾滴定法。

1.3数据分析

测定数据均用Excel进行统计，用Graph Pad Prism 5.0进行数据分析，统计作图比较。

2结果与分析

2.1不同分子量的γ-聚谷氨酸对绿豆种子萌发及幼苗生长的影响

2.1.1不同分子量的γ-聚谷氨酸对绿豆种子萌发的影响由表1可知，不同分子量的γ-聚谷氨酸处理对绿豆种子萌发有明显的差异。γ-聚谷氨酸相对分子质量为10～120 ku 时，随着γ-聚谷氨酸相对分子质量的升高，发芽势和发芽率逐渐提高，其中用120 ku的γ-聚谷氨酸处理绿豆种子，其发芽势最高，达到81.85%，较对照提高了21.25百分点，发芽率达到了98.15%。 用1 200 ku的γ-聚谷氨酸处理绿豆种子，种子的发芽势和发芽率均呈下降趋势，但仍比对照略高。当γ-聚谷氨酸的相对分子质量提高至 2 000 ku 时，绿豆种子的萌发受到了抑制，发芽势较对照减少了11.03百分点，发芽率也有所降低。由此可见，低分子量的γ-聚谷氨酸对绿豆种子的萌发起促进作用，而高分子量的γ-聚谷氨酸对绿豆种子萌发起抑制或延缓作用。

2.1.2不同分子量的γ-聚谷氨酸对绿豆幼苗生长的影响从图2可知，10～1 200 ku的γ-聚谷氨酸处理绿豆幼苗时，主根长、株高以及鲜质量均有显著提高，其中120 ku的 γ-聚谷氨酸处理绿豆幼苗主根最长，达到14.25 cm，相应地，120 ku的γ-聚谷氨酸处理绿豆幼苗的株高、地上部分鲜质量和地下部分鲜质量也最大，差异均达到显著水平。这与其主根最长有很大的相关性，因为根是植物最重要的吸收水分和运输养料的器官，根系的生长直接影响到幼苗的生长发育状况。2 000 ku的γ-聚谷氨酸处理绿豆主根长、株高以及鲜质量较对照值小，相比差异不明显。由此可见，10～1 200 ku 的γ-聚谷氨酸处理对绿豆萌发期幼苗的主根长、株高和鲜重均有不同程度的促进作用，说明低分子量的γ-聚谷氨酸处理对绿豆幼苗的地上部分和地下部分的生长发育都有很好的促进作用，而高分子量的γ-聚谷氨酸可能使幼苗生长受到抑制。

2.2不同分子量的γ-聚谷氨酸对绿豆萌发期淀粉酶、过氧化氢酶及过氧化物酶活性的影响

种子内部的一切生理生化反应都是在特定酶的催化下进行的，酶的活性高低与种子的活力密切相关。由图3可知，10～120 ku 的γ-聚谷氨酸处理绿豆种子时，种子萌发后的淀粉酶活性、过氧化氢酶活性及过氧化物酶活性均显著增强，与对照相比差异较显著。而1 200 ku和2 000 ku高分子量的γ-聚谷氨酸处理绿豆种子时，种子的淀粉酶活性、过氧化氢酶活性及过氧化物酶活性均呈下降趋势。由此可见，低分子量的γ-聚谷氨酸处理绿豆种子时，随着γ-聚谷氨酸相对分子质量的提高，种子萌发期的淀粉酶活性、过氧化氢酶活性及过氧化物酶活性逐渐增强，其中120 ku的γ-聚谷氨酸处理，除了过氧化氢酶，其余各种酶活性达到最大，淀粉酶活性、过氧化氢酶活性及过氧化物酶活性分别是对照的2.29倍、1.41倍和1.87倍。

3结论与讨论

植物种子发芽指标是反映种子活力大小的最可靠指标，也是反映种子萌发耐逆性能的最直接指标。种子在适宜条件下萌发时，淀粉酶活性随萌发时间延长迅速提高，将胚乳中的淀粉分解成糖类供幼苗生长发育。种子的萌发状态与淀粉酶的活性有关，酶活性越高，种子活力越高。绿豆经γ-聚谷氨酸处理后，种子的淀粉酶活性提高，这与种子的发芽势、发芽率和幼苗的根长、株高及鲜质量提高具有一致性。种子活力的提高，能够促进种子发芽，促进幼苗的生长发育，因此，γ-聚谷氨酸在种子萌发及苗期生长过程中具有重要的作用。

低分子量的γ-聚谷氨酸（10～1 200 ku）促进了绿豆萌发和幼苗的生长，而高分子量的γ-聚谷氨酸（2 000 ku）可能使种子萌发和幼苗生长处于受胁迫的状态，这种胁迫可导致植物代谢系统紊乱，产生大量的活性氧，使脂质过氧化并导致细胞膜损伤，而植物为避免活性氧对膜的损害，将启动抗氧化机制。生物体中的过氧化氢酶和过氧化物酶是活性氧的主要消除系统，植物体靠增加抗氧化酶的生成量来消除活性氧，保护植物细胞膜系统免受伤害。经γ-聚谷氨酸处理的绿豆种子，过氧化氢酶和过氧化物酶活性明显提高，这样可以更有利地保护膜免受活性氧伤害，使种子在一定程度上免受自由基侵害。

在正常生理条件下，植物在代谢过程中超氧化物自由基等活性氧的产生及其消除存在一个平衡，因此植物不会累积活性氧。在低分子量（10～1 200 ku）的γ-聚谷氨酸诱导下，绿豆通过提高保护酶的活性增强植物的抗氧化能力，而高分子质量（2 000 ku）的γ-聚谷氨酸可能使种子萌发和幼苗生长处于受胁迫状态而产生更多的活性氧，随着活性氧的增加，超过抗氧化酶系统的自我清除能力，从而引起过氧化氢酶和过氧化物酶活性降低。

已有研究表明，γ-聚谷氨酸具有提高作物种子对逆境的耐受性，在以PEG-6000模拟干旱胁迫的条件下，施用外源γ-聚谷氨酸可提高小麦和黑麦草的发芽率，减缓干旱胁迫下钾离子含量降低的速率，参与植物的渗透调节作用，从而增强植物耐旱性[14-18]。2013年，张言芳等研究表明，低温胁迫下，γ-聚谷氨酸处理水稻种子可以提高抗氧化酶活性，降低膜脂过氧化程度，提高水稻的耐冷性[19]。2007年Jaleel等发现，干旱胁迫条件下长春花体内聚谷氨酸激酶活性会显著提高[20]。这些研究都表明γ-聚谷氨酸具有抗旱保水的潜力，植物体内抗氧化酶的活性直接决定了其抗逆性能的强弱。

γ-聚谷氨酸广阔的发展前景和巨大的开发潜力使其成为2l世纪氨基酸工业的发展趋势之一。聚谷氨酸的生物可降解性、增肥效应及抗旱促苗作用已成为农业研究和应用的热点。我们的研究也表明，γ-聚谷氨酸能够有效地促进绿豆种子的萌发和幼苗的生长发育。γ-聚谷氨酸溶液浸种对植物生长发育的影响可能是个长期而复杂的过程，它对植物生长发育的作用能否持续到后期，是否可以提高产量和改良品质，还有待于进一步深入研究。

参考文献：

[1]Meynell G G，Meynell E. The biosynthesis of poly d-glutamic acid，the capsular material of Bacillus anthracis[J]. Journal of General Microbiology，1966，43（1）：119-138.

[2]Bovarnick M. The formation of extracellular D-glutamic acid polypeptide by Bacillus subtilis[J]. Journal of Biological Chemistry，1942，145（2）：415-424.

[3]游庆红，张新民，陈国广，等. γ-聚谷氨酸的生物合成及应用[J]. 现代化工，2002，22（12）：56-59.

[4]疏秀林，施庆珊，黄小茉，等. γ-聚谷氨酸及其衍生物在生物医学领域中的应用[J]. 中国组织工程研究，2012，16（16）：3009-3012.

[5]Auzenne E，Donato N J，Li C，et al. Superior therapeutic profile of poly-L-glutamic acid-paclitaxel copolymer compared with taxol in xenogeneic compartmental models of human ovarian carcinoma[J]. Clinical Cancer Research，2002，8（2）：573-581.

[6]何观辉. 聚谷氨酸与聚谷氨酸水胶——化妆品原料家族中的新“明星”[J]. 中国化妆品：专业版，2006（11）：16-17.

[7]Liu X，Liu F，Liu S Y，et al. Poly-γ-glutamate from Bacillus subtilis inhibits tyrosinase activity and melanogenesis[J]. Applied Microbiology & Biotechnology，2013，97（22）：9801-9809.

[8]Ben-Zur N，Goldman D M. γ-Poly glutamic acid：a novel peptide for skin care[J]. Cosmetics & Toiletries，2007，122：64-72.

[9]Choi H J，Kunioka M. Preparation conditions and swelling equilibria of hydrogel prepared by γ-irradiation from microbial poly（γ-glutamic acid）[J]. Radiation Physics & Chemistry，1995，46（2）：175-179.

[10]王润凡，尹业雄，胡世权，等. PGA增效剂在温州蜜柑中施用效果的评价[J]. 湖北农业科学，2010，49（4）；884-887.

[11]刘端义，梅金先，张旅峰，等. 聚-γ-谷氨酸及其增效肥在水稻上的应用[J]. 湖北农业科学，2010，49（10）；2390-2394，2400.

[12]李汉涛，杨国正，柯云，等. 聚γ-谷氨酸增效复合肥对油菜产量及其构成因素的影响[J]. 湖北农业科学，2010，49（10）：2395-2397.

[13]许宗奇，万传宝，许仙菊，等. 肥料增效剂γ-聚谷氨酸对小青菜产量和品质的影响[J]. 生物加工过程，2012，10（1）：58-62.

[14]王传海，何都良，郑有飞，等. 保水剂新材料γ-聚谷氨酸的吸水性能和生物学效应的初步研究[J]. 中国农业气象，2004，25（2）：19-22.

[15]尹成红，雍晓雨，冉炜，等. 产γ-聚谷氨酸菌株的筛选及其对玉米幼苗生长的影响[J]. 南京农业大学学报，2011，34（2）：91-96.

[16]疏秀林，施庆珊，冯劲，等. γ-聚谷氨酸对荔枝常温货架保鲜效果研究[J]. 食品工业科技，2012，33（21）：318-321.

[17]张新民，姚克敏，徐虹. 新型高效吸水材料（γ-PGA）的农业应用研究初报[J]. 南京气象学院学报，2004，27（2）：224-229.

[18]朱安婷，蒋友武，谢国生，等. 外源聚γ-谷氨酸对水稻幼苗耐旱性和渗透调节的影响[J]. 核农学报，2010，24（6）：1269-1273.

[19]张言芳，周慧梅，蔡克桐，等. 无机盐混合试剂与γ-PGA复合处理对早稻苗期耐冷性的引发和分子效应分析[J]. 农业环境科学学报，2013，32（12）：2323-2330.

[20]Jaleel C A，Manivannan P，Sankar B，et al. Water deficit stress mitigation by calcium chloride in Catharanthus roseus：effects on oxidative stress，proline metabolism and indole alkaloid accumulation[J]. Colloids & Surfaces B： Biointerfaces，2007，60（1）：110-116.