UPLC法同时测定地锦草中4种指标成分的含量*

冯光维，刘志东，祁东利，皮佳鑫，顾　星，张　谦，黄　瑞

（1.天津中医药大学现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心，天津　300193；2.黔南民族医学高等专科学校，都匀　558000）



UPLC法同时测定地锦草中4种指标成分的含量*

冯光维1，2，刘志东1，祁东利1，皮佳鑫1，顾星1，张谦1，黄瑞1

（1.天津中医药大学现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心，天津300193；2.黔南民族医学高等专科学校，都匀558000）

摘要：［目的］建立同时测定地锦草药材中没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚4种指标成分的超高液相色谱法（UPLC）。［方法］采用UPLC法，色谱柱为Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为甲醇-乙腈4∶6（A）-0.2%甲酸水（B）溶液，梯度洗脱：0～3 min，5%A；3～4 min，5%～17%A；4～19 min，17%A；19～42 min，17%～30% A；42～50 min，30%～34%A；50～55 min，34%～70%A，体积流量0.2 mL/min；检测波长为0～4 min，270 nm；4～55 min，360nm，柱温30℃。［结果］4种成分均达到基线分离，各成分在线性范围内有良好的线性关系（r＞0.999 7）；回收率在96.5%～102.9%。［结论］建立的测定方法准确灵敏、重复性好，能较全面地评价地锦草药材的质量。

关键词：UPLC；同时测定；地锦草；含量

地锦草为大戟科植物地锦（Euphorbia humifusa Willd.）或斑地锦（Euphorbia maculate L.）的干燥全草，分布于全国各地，具有清热解毒、利湿退黄、活血止血的功效，临床上主要治疗细菌性痢疾、肠炎、痈肿疔疮和湿热黄疸等［1-2］。地锦草中化学成分主要是没食子酸、鞣花酸等有机酸类和槲皮素、山奈酚等黄酮类化合物［3-8］，其中没食子酸具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等活性［9］，鞣花酸具有抗氧化、抗肿瘤、抗突变等活性［10］，槲皮素、山奈酚均具有抗炎、抗氧化、抗菌等活性［11-12］。中国药典以槲皮素作为地锦草的质控指标，同时有文献采用高效液相色谱法（HPLC）测定地锦草中成分［13-15］，但对其多指标成分的测定较少报道。超高效液相色谱法（UPLC）测定具有方法简便，分析时间短，溶剂消耗少等特点，尤其适用于中药材多指标成分的定量检测。本研究采用UPLC技术［16-20］，建立了UPLC法测定地锦草中没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚含量的方法，更加全面的控制地锦草药材的质量，对地锦草制剂开发及质量控制提供可靠依据。

1仪器与材料

Waters Acquity超高效液相色谱仪，配置四元高压泵、在线脱气装置、自动进样器、柱温箱、TUV检测器，美国Waters公司；Sorvall ST16R高速离心机，德国Thermo Scientific公司；Milli—Q超纯水机，德国Millipore公司；KQ-300B超声清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；FW177型中草药粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；Mettler Toledo XP205电子分析天平，Mettler Toledo仪器有限公司；FA124型天平，上海舜宇恒平有限公司。

没食子酸（批号110831-201204）、槲皮素（批号100080-201408）对照品由中国食品药品检定研究院提供；鞣花酸（批号W16-5-0）、山奈酚（批号W13-5-9）对照品由天津中新药业有限公司提供，质量分数均≥98%。甲醇、乙腈均为色谱纯，Fisher Scientific公司；水为超纯水；甲酸为色谱纯，购自日本东京化成工业株式分社。地锦草药材分别收集于贵州、河南、安徽、广西等产地，共12批，经天津中医药大学中医药研究院刘志东博士鉴定为大戟科植物地锦（Euphorbia humifusa Willd.）的干燥全草。药材信息见表1。

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱为Acquity UPLC BEH C18（100mm×2.1mm，1.7μm），检测波长为0～4min，270 nm，4～55 min，360 nm；柱温30℃；体积流量0.2 mL/min；进样量为2 μL；流动相为甲醇∶乙腈4∶6（A）-0.2%甲酸水（B）进行梯度洗脱，洗脱程序见表2。

表1　12批地锦草药材来源

表2　梯度洗脱程序表

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备精密称取没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚对照品适量，加甲醇制成浓度分别为:412.0、608.0、200.0、10.0 mg/L混合对照品储备液。分别精密量取0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.6、2.0 mL储备液置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制得系列混合对照品溶液，避光保存。

2.2.2供试品溶液的制备称取地锦草粉末（过三号筛）2.0 g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，称质量，超声处理45 min（频率40 KHz，功率300 W），放冷、称质量，加80%甲醇补足减失的质量，摇匀，12000r/min离心10min，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.3系统适应性实验分别精密吸取混合对照品溶液及供试品溶液2 μL，按“2.1”项色谱条件进样，结果4种被测成分均能达到基线分离，与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数以各色谱峰计均超过10 000，峰形较好。UPLC色谱图见图1。

图1　4种混合对照品溶液（A）和供试品溶液（B）的UPLC色谱图

2.4线性关系考察在“2.1”项色谱条件下，分别精密量取系列质量浓度的混合对照品溶液2 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。分别按照色谱条件依次进样，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程。结果见表3。

表3　4种指标成分线性关系考察结果

2.5精密度实验取混合对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下，连续进样6次，进样体积为2 μL，以对照品峰面积进行计算，没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚峰面积的RSD分别为0.66%、0.55%、0.80%、1.39%，表明仪器精密度良好。

2.6稳定性实验取待测地锦草（编号S2）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件操作，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测定没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚的峰面积，按峰面积计算得RSD分别为0.80%、0.97%、1.18%、1.33%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7重复性实验取同一批次地锦草药材粉末（编号S2）约2.0 g，平行称定6份，按“2.2.2”项下方法操作，制备供试品溶液6份，每份精密吸取2 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，分别测得没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚质量分数的RSD分别为1.80%、1.40%、1.76%、1.21%，表明方法重复性良好。

2.8加样回收率实验取已测定的地锦草药材（编号S2）粉末6份，每份1.0 g，精密称定，每份加入相同量的没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚对照品，按“2.2.2”项下方法操作，制备供试品溶液，按“2.1”项下条件测定，结果平均回收率分别为96.5%、102.9%、96.9%、97.0%，RSD分别为1.34%、1.22%、0.91%、1.30%。

2.9样品测定取收集于贵州、河南、安徽、广西等不同产地的12批地锦草药材，分别称取地锦草药材粉末约2.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法操作，制备供试品溶液，平行3份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，并计算样品中4种指标成分的含量，结果见表4。

表4　地锦草药材中4种指标成分含量测定结果（n=3）

结果表明，贵州、河南、安徽、广西产地12批次的地锦草药材中4种指标成分的含量存在一定差异，其中没食子酸含量差异较大，以广西产的含量最高，这可能与土壤、环境、采收季节、加工过程等有关。

3　讨论

本实验考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇∶乙腈（4∶6）-0.1%甲酸水混合溶剂系统对地锦草成分分离度的影响，结果发现甲醇∶乙腈（4∶6）-0.1%甲酸水混合溶剂系统能够使色谱峰达到完全分离。同时考察了甲酸用量对色谱峰对称性的影响，结果发现，0.2%甲酸水溶液对色谱峰对称性较好，且甲酸易挥发的性质适用于UPLC的测定，故最终确定甲醇∶乙腈（4∶6）-0.2%甲酸水溶液作为流动相。

在样品处理过程中，考察了甲醇、80%甲醇、50%甲醇3种溶剂的提取效率，结果表明80%甲醇作为提取溶剂时，各指标成分的含量较高，故选择80%甲醇作为提取溶剂。

超声提取各成分，考察了30、45、60 min超声时间的提取效果，发现超声30 min时各成分的含量相对较低；45 min和60 min各成分的含量基本一致，故提取时间选择45 min。

测定波长的选择上，没食子酸的最大吸收为270 nm，鞣花酸、槲皮素、山奈酚均在360 nm时有强吸收，并且基线平稳，故确定其测定波长为0～4 min时波长为270 nm，4～55 min时波长为360 nm。

《中国药典》2015年版采用酸水解的方法对地锦草中黄酮苷进行降解，测定降解产物槲皮素的含量；而本实验采用有机溶剂直接提取药材中的有效成分进行含量测定，更能准确反映各指标成分在药材中的真实含量。

本实验建立了UPLC法测定地锦草中4种指标成分的方法，分析了4个产地12批药材中有机酸和黄酮类成分的含量，黄酮类成分含量地域差异较小，而有机酸类成分含量差异较大，为地锦草药材的质量控制提供了科学依据。

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中图分类号：R284

文献标志码：A

文章编号：1673-9043（2016）03-0196-04

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.03.12

收稿日期：（2016-03-01）

*基金项目：黔南民族医学高等专科学校科研基金资助项目（QNYZ2014014）。

作者简介：冯光维（1982-），男，少数民族骨干硕士，讲师，主要从事中药制剂及质量标准研究。

通讯作者：刘志东，E-mail:lonerliuzd@163.com。

Simultaneous determination of four components in Euphorbia Humifusa Willd.by UPLC

FENG Guang-wei1，2，LIU Zhi-dong1，QI Dong-li1，PI Jia-xin1，GU Xing1，ZHANG Qian1，HUANG Rui1
（1.EngineeringResearch Center of Modern Chinese Medicine Discovery and Preparation Technique，Ministry of Education，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Qiannan Medical College for Nationalities，Duyun，Guizhou，558000，China）

Abstract:［Objective］To establish an UPLC method for simultaneous determination four index components such as gallic acid，ellagic acid，quercetin and kaempferol in Euphorbia Humifusa Willd.［Methods］A chromatographic separation method was established with Acquity UPLC BEH C18column（100 mm×2.1 mm，1.7μm）with methanol-acetonitrile（40∶60，A）-0.2%formic acid（B）as mobile phases at the flow rate of 0.2 mL/min.The gradient elution was carried out as follows:0～3 min，5%A；3～4 min，5%～17%A；4～19min，17%A；19～42 min，17%～30%A；42～50 min，30%～34%A；50～55 min，34%～70%A.The detection wavelength was 270 nm at 0～4 min and 360 nm at 4～55 min，and the column temperature was 30℃.［Results］The four index components were well separated and each component had a good linear relationship in the liner range（r＞0.999 7）；and the recovery was in the range of 96.5%～102.9%.［Conclusion］The method is accurate，sensitive and repeatable for the comprehensive quality control of Euphorbia Humifusa Willd.

Key words:UPLC；simultaneous determination；Euphorbia HumifusaWilld.；content