和营安心方抗炎及促进血管再生作用的研究*

贺　伟，李永民，张海霞，陈玺龙，苏志远

（河北北方学院，张家口　075029）



和营安心方抗炎及促进血管再生作用的研究*

贺伟，李永民，张海霞，陈玺龙，苏志远

（河北北方学院，张家口075029）

摘要：［目的］研究和营安心方对老化大鼠心血管系统的保护作用。［方法］采用过氧化氢（H2O2）建立大鼠血管平滑肌细胞炎症损伤模型，实验分为5组，正常对照组、H2O2（200 μmol/L）模型组、和营安心方高、中、低剂量组，分别加入“和营安心方”提取物100、50、25 mg/L，24 h之后加入与模型组同浓度的H2O2（200 μmol/L），共同作用2 h，观察血管平滑肌细胞培养液中一氧化氮（NO）含量。以大鼠颈背部皮下注射125 mg/kg D-半乳糖建立大鼠老化模型，用实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）法检测大鼠脑组织及肝脏组织中一氧化氮合酶（NOS）及碱性成纤维因子（b-FGF）的表达，实验分为6组，分别为正常组、模型组（D-半乳糖125 mg/kg）、和营安心方高剂量组（500 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg）、和营安心方中剂量组（250 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg）、和营安心方低剂量组（125 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg）及青年大鼠组。［结果］和营安心方能显著性降低大鼠血管平滑肌细胞上清液中NO的含量，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），实时荧光定量PCR法测定结果显示，相对于模型组，和营安心方能显著性降低大鼠脑组织和肝脏组织中NOS的表达，提高b-FGF在大鼠脑及肝脏组织中的表达（P＜0.01）。［结论］和营安心方对老化大鼠的心血管再生及抗炎等方面有一定程度的保护作用，提示和营安心方可能通过直接作用于脑及肝脏组织来发挥促进血管再生及抗炎的功效。

关键词：和营安心方；血管平滑肌细胞；老化大鼠；心血管系统

依据《难经》“损其心者，调其营卫”治则，自拟“和营安心方”，用于缺血性心脏病的治疗，其具有“调和营卫，活血利水”的功效。前期研究已经证实其具有一定的抗氧化、改善心功能、抑制心肌细胞凋亡、降低心肌缺血损伤等作用［1-2］。流行病学调查显示，炎症及心血管相关疾病发病率呈逐年上升趋势，而由于老龄化造成的相关心血管疾病的发病率更高，已经成为危害人类健康的重大疾病。在炎症过程中损伤因子可以直接或间接造成组织和细胞的破坏，从而影响人类健康。本实验主要研究“和营安心方”对H2O2致大鼠血管平滑肌细胞炎症损伤模型及老化大鼠心血管系统的保护作用，并进一步探讨其作用机制，具有及其重要的意义。

1　材料与方法

1.1药物与试剂 “和营安心方”由桂枝、白芍、茯苓、西洋参、益母草等药物组成，整个方剂共计500 g，用70%乙醇，按照料液比为1∶6的比例进行提取，每次提取1.5 h，共提取3次，收集3次的提取液，将提取液浓缩为浸膏得到93.5 g，提取率为18.7%。大鼠血管平滑肌细胞（VSMC，购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），DMEM-H液体培养基（Hyclone），新生胎牛血清（Gibco产品，美国），0.25%胰蛋白酶溶液（Dibco产品，美国），3%（W/W）过氧化氢（H2O2），（Sigma公司，美国），一氧化氮（NO）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），引物合成（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），SD大鼠（3月龄和5周龄）由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证编号：0029985。

1.2主要仪器二氧化碳（CO2）细胞培养箱（Thermo），HH-S6数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂），倒置荧光显微镜（Olympus），ALLEGRA-64R高速离心机、DU-530紫外分光光度计（美国Beckman Coulter有限公司），Flex Station3多功能微孔板分析仪（美国Molecular Devices公司），ARKTIK基因扩增仪（Thermo），7300 Real-Time PCR system实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）。

2　实验方法

2.1血管平滑肌细胞的培养血管平滑肌细胞（VSMC）培养至80%～90%融合时，加消化液（0.25%胰酶含0.03%EDTA）1.5 mL，预洗倒掉，显微镜下观察细胞基本脱离瓶壁分离成单个细胞时，加培养基吹洗混匀，按照1∶3传代，每瓶加培养基6 mL，37℃5%CO2孵育箱培养。

2.1.1实验分组将消化后的细胞按照6×105的密度接种于48孔板内进行培养。组别分别为：1）正常培养的血管平滑肌细胞即正常对照组。2）血管平滑肌细胞培养液中添加终浓度为200 μmol/L的H2O2作用2 h即炎症损伤模型组。3）血管平滑肌细胞分别用高、中、低3种剂量浓度的和营安心方乙醇提取物（100、50、25 mg/L）培养24 h后，添加终浓度200 μmol/L H2O2继续作用2 h。最终收集血管平滑肌细胞及培养上清液用于实验。

2.1.2NO含量测定通过NO检测试剂盒测定培养介质中炎症因子NO（单位：μmol/L）的含量，评价和营安心方对大鼠血管平滑肌细胞的保护作用，测定采用紫外分光光度法。

2.2实时荧光定量PCR法测定实验大鼠脑组织及肝脏组织中一氧化氮合酶（NOS）、碱性成纤维因子（b-FGF）的表达取40只体质量220～240 g雄性SD大鼠（3月龄）及8只青年SD大鼠（5周龄）适应性喂养1周，老龄大鼠按随机数字表法随机分为5组，每组8只，分别为正常组、模型组（D-半乳糖125 mg/kg颈背部皮下注射，造成老化鼠模型［3］）、和营安心方高剂量组（500mg/kg+D-半乳糖125mg/kg）、和营安心方中剂量组（250mg/kg+D-半乳糖125mg/kg）、和营安心方低剂量组（125mg/kg+D-半乳糖125mg/kg），8只青年大鼠为青年组，其中正常组及青年组灌服等容积的5%阿拉伯胶，每组给药剂量均为100 mL/kg，共给药及造模42 d，实验前禁食不禁水18 h，第42天给药后，将各组大鼠断头处死，立即取脑、肝脏等组织，置于-80℃保存。

2.2.1抽提总RNA及cDNA合成用Trizol抽提总RNA：取组织100 mg左右置于经高温灭菌的研钵中，在研钵中加入1 mL Trizol进行裂解研磨，随之加入适量液氮于研钵进行反复研磨，至组织完全溶解，裂解液透明，转入Eppendorf管。4℃12 000 g离心5 min，取上清，转入一个新的Eppendorf管中，去除不溶物等。加入0.2 mL氯仿，涡旋混合，使溶液充分乳化，室温放置3min。4℃12000g离心15min，样品分成3层，上清水相转移到新管中。加入与上清相同体积的异丙醇混匀，室温放置5～10 min。4℃12 000 g离心10 min弃上清，白色或淡黄色RNA沉于管底。加1 mL 75%乙醇，振荡离心管，悬浮洗涤沉淀。4℃8 000 g离心5 min，弃去上清。真空干燥后溶于10 μL无RNA酶水。用紫外分光光度计测定总RNA浓度及A260 nm/A280 nm比值，测定RNA纯度。按High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit试剂盒说明进行反转录，合成cDNA。

2.2.2引物设计及合成根据美国国家生物技术信息中心（NCBI）公布的大鼠基因序列，设计上下游引物。见表1。

表1　基因序列

2.3统计分析采用SPSS 18.0统计软件分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

3　实验结果

3.1细胞培养液中NO含量测定结果见表2，和营安心方高、中、低剂量组均能很好的降低造模后的血管平滑肌细胞培养液中NO的含量，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

3.2实时荧光定量PCR测定实验大鼠脑及肝脏组织中NOS、b-FGF的表达结果见表3、表4。与模型组比较，和营安心方高剂量组（P＜0.05）、中剂量组（P＜0.01）能够降低大鼠脑组织中NOS的表达，和营安心方高剂量（P＜0.01）、低剂量组（P＜0.05）能够降低大鼠肝脏组织中NOS的表达。和营安心方中剂量、低剂量组能够显著性提高b-FGF在大鼠脑组织中的表达，和营安心方高剂量（P＜0.05）、中剂量组（P＜0.01）能够显著性提高b-FGF在大鼠肝脏组织中的表达。

表2　细胞培养液中NO含量（±s）

表2　细胞培养液中NO含量（±s）

注：与模型组比较，**P＜0.05；与正常组比较，##P＜0.05。

组别正常组模型组和营安心方（高剂量）和营安心方（中剂量）和营安心方（低剂量）n　6 6 6 6 6剂量　NO（μmol/L）-4.93±0.70 200 μmol/L H2O2　14.07±0.47##100 mg/L+200 μmol/L H2O2　5.30±0.41** 50 mg/L+200 μmol/L H2O2　9.85±0.57** 25 mg/L+200 μmol/L H2O2　6.65±0.55**

4　讨论

《内经》在阐述“营卫致病”时提出了“营气衰少而卫气内伐”，和“营气稽留，血涩不行，卫气从之”的病机，据此提出了慢性心力衰竭的中医病机假说为“营卫不和，营涩卫伐，淤结水停”，并拟定“和营安心方”，本方由西洋参、玉竹、桂枝、白芍、茯苓等组成。西洋参、玉竹益气生津，充养营气，益营和阴；桂枝、茯苓疏卫通阳，活血化瘀，利水宁心。全方补气生津，益营通卫，调和营卫，活血利水。现代药理研究表明，西洋参、玉竹、桂枝等都具有一定的抗氧化、抗炎、强心、提高免疫力等功效。“和营安心方”具有抗氧化、改善心功能、抑制心肌细胞凋亡、降低心肌缺血损伤等作用，H2O2是极强的氧化剂，是体内氧化代谢的中间产物，H2O2很容易穿透细胞膜到达胞内位点，如果H2O2的积累对细胞产生细胞毒性，将会对机体造成及其严重的后果。在本实验中用低浓度（200 μmol/L）H2O2模拟炎症损伤状态，以造成血管平滑肌细胞炎症损伤，进而来观察“和营安心方”对血管平滑肌细胞的影响作用，从而推测其对心血管系统的影响［4］。

NO是一个很重要的炎症因子，在炎症部位，NO作用于细胞，可使其cGMP水平显著升高，使血管舒张，通透性增高，利于炎症介质到达作用部位［5-7］。在多种炎症性或免疫性的动物实验模型中，NO浓度显著增高，抑制NO合成可使典型的炎症症状得到改善，因此本实验以细胞上清液中NO的含量作为炎症损伤程度的检测指标，更能够准确的反映“和营安心方”对H2O2致大鼠血管平滑肌细胞炎症损伤的保护作用。

NOS作为NO合成的关键酶，可分为3种类型：神经元型（nNOS）、内皮型（eNOS）和诱导型（iNOS），前两者的激活依赖于钙离子和钙调蛋白的作用，iNOS可由炎症因子、内毒素等诱导激活。大鼠颈背部皮下注射D-半乳糖（125 mg/kg）造成的老化大鼠模型，能够全面模拟老化大鼠的生理状态，老化状态会造成一定程度的炎症反应，进而促使NO含量升高，本实验以合成NO的NOS为检测指标，探索“和营安心方”对老化大鼠的保护作用。

表3　脑、肝脏组织中NOS基因的表达（±s）

表3　脑、肝脏组织中NOS基因的表达（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.01，**P＜0.05；与正常组比较，#P＜0.01，##P＜0.05。

组别正常组（3月龄）模型组青年组（5周龄）和营安心方（高剂量）和营安心方（中剂量）和营安心方（低剂量）n　8 8 8 8 8 8剂量　NOS（脑）　NOS（肝脏）5%阿拉伯胶　0.52±0.05**　0.47±0.07* D-半乳糖125 mg/kg　1.30±0.23##　0.72±0.10#5%阿拉伯胶　0.68±0.18**　0.63±0.06#500 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg　0.44±0.05**　0.47±0.06* 250 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg　0.86±0.09*　0.82±0.15##125 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg　1.12±0.06#　0.41±0.02**#

表4　脑、肝脏组织中b-FGF基因的表达（±s）

表4　脑、肝脏组织中b-FGF基因的表达（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.01，**P＜0.05；与正常组比较，#P＜0.01，##P＜0.05。

组别正常组（3月龄）模型组青年组（5周龄）和营安心方（高剂量）和营安心方（中剂量）和营安心方（低剂量）n　8 8 8 8 8 8剂量　b-FGF（脑）　b-FGF（肝脏）5%阿拉伯胶　2.15±0.25**　1.07±0.14** D-半乳糖125 mg/kg　0.46±0.10##　0.19±0.02##5%阿拉伯胶　1.08±0.06##　0.62±0.09*##500 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg　1.12±0.23##　1.16±0.20** 250 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg　1.51±0.24*　0.67±0.13*##125 mg/kg+D-半乳糖125 mg/kg　1.45±0.08*#　0.35±0.05##

b-FGF属于FGF家族，是一种广谱的促神经生长因子和促神经细胞分裂因子，其广泛分布于成熟和未成熟的中枢神经系统内，可刺激成纤维细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞的生长，促进血管新生，对维护中枢神经系统正常功能起重要作用［8］，实验中以b-FGF为指标检测“和营安心方”对老化大鼠血管再生的影响作用。

实验结果显示，和营安心方高、中、低剂量组均能显著性降低由200 μmol/L H2O2所造成的大鼠血管平滑肌细胞上清液中NO含量的升高，与模型组比较有显著性差异（P＜0.05）；NOS是合成NO的一种关键酶，其含量的高低直接会影响到NO的含量，实时荧光定量PCR结果显示，和营安心方能够一定程度上降低大鼠脑及肝脏组织中NOS的表达，对比于模型组有显著性差异。b-FGF是评价血管新生的一个很好的检测指标，其能很好的刺激血管新生及血管平滑肌细胞的生长，检测结果显示，对比于模型组，和营安心方能够一定程度上显著性升高大鼠脑及肝脏组织中b-FGF的表达。和营安心方正是由于这些作用的体现来实现其对炎症损伤的保护作用及对血管再生的促进作用，提示“和营安心方”可能通过直接作用于脑及肝脏组织来发挥其抗炎及促进血管再生的作用。

参考文献：

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［8］李国前，杨小霞，王杰华，等.尤瑞克林对脑缺血再灌注后促血管生长因子的影响［J］.中药临床药理学杂志，2014，30（12）:1098-1100.

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1673-9043（2016）03-0176-04

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.03.08

收稿日期：（2016-02-17）

*基金项目：河北北方学院创新人才培育基金课题（CXRC1319）。

作者简介：贺伟（1985-），女，硕士，讲师，主要从事中药药理、中药化学研究工作。

通讯作者：李永民，E-mail:liyongmin2001@sina.com。

Protective effect of Heying Anxin formula on anti-inflammatory and promoting angiogenesis

HE Wei，LI Yong-min，ZHANG Hai-xia，CHEN Xi-long，SU Zhi-yuan
（Hebei North University，Zhangjiakou 075029，China）

Abstract:［Objective］To investigate protective effects and mechanisms of Heying Anxin formula on the cardiovascular system of aging rats.［Methods］Rat vascular smooth muscle cells were incubated by H2O2（200 μmol/L）for 2 h as inflammation model group，same dose of H2O2was administered 2 h after treatment with Heying An xin formula（100 μg/mL，50 μg/mL，25 μg/mL）as therapeutic group and incubated for another 24 h，content of NO were measured.Subcutaneous injection in neck and back of D-galactose（125 mg/kg）to establish aging rats model.Model group:D-galactose（125 mg/kg），Heying Anxin formula（500 mg/kg+D-galactose 125 mg/kg，250 mg/kg+D-galactose 125 mg/kg、125mg/kg+D-galactose 125 mg/kg）as treating groups，as well as normal group and young group.The RTPCR technique was used to measure the expression of relevant genes，such as nitrous oxide system（NOS）and basic fibroblast growth factor（b-FGF）in the tissues of brain and liver.［Results］Heying Anxin formula can significantly decrease the content of NO（P＜0.05 vs control group），also compared with that of control group，He ying Anxin formula can significantly decrease NOS expression and enhance b-FGF expression in rats brain and liver tissues （P＜0.01）.［Conclusion］Heying Anxin formula has greatly protective effects on anti-inflammatory and cardiovascular regeneration of aging rats，and it may be take effect by the brain and liver.

Key words:Heying Anxin formula；vascular smooth muscle cells；aging rats；cardiovascular system