支气管哮喘患者Th17和Th9细胞及其细胞因子的表达及临床意义

李　志，杨婷婷，李文哲，王　波，薛邦禄

(1.大连市中心医院 检验科，辽宁 大连116033；2.大连医科大学基础医学院，辽宁 大连116044)



支气管哮喘患者Th17和Th9细胞及其细胞因子的表达及临床意义

李志1，杨婷婷1，李文哲2，王波1，薛邦禄1

(1.大连市中心医院 检验科，辽宁 大连116033；2.大连医科大学基础医学院，辽宁 大连116044)

摘要：目的测定支气管哮喘(Bronchial asthma)患者体内辅助性T细胞(Th )17和Th9细胞及其细胞因子白细胞介素(Interleukin,IL)17和IL-9的水平，探讨两种细胞的表达与哮喘的发病机制之间的关系。方法采用流式细胞术(Flow CytoMetry，FCM)检测患病组和对照组外周血中Th17和Th9细胞的比例；应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中IL-17和IL-9的的含量。测得数据采用SPSS19.0统计软件进行分析。结果与对照组相比，哮喘组患者外周血中Th17 和Th9细胞表达比例及IL-17和IL-9的浓度显著升高(P<0.05)。结论Th17和Th9细胞的变化可能在哮喘发病机制中发挥重要作用

关键词：支气管哮喘；辅助性T细胞17；辅助性T细胞9；IL-17；IL-9

(Chin J Lab Diagn,2016,20:0949)

支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞、淋巴T细胞和肥大细胞等多种细胞参与的慢性气道炎症，而CD4+T淋巴细胞在哮喘气道炎症中扮演重要的角色。目前研究显示T淋巴细胞亚型Th17和Th9细胞均被证实与哮喘的发病有一定的关系，本研究通过检测哮喘患者外周血Th17、Th9细胞与其相关细胞因子IL-17和IL-9等的表达水平，探讨Th17与Th9细胞在哮喘发病中的意义。

1材料与方法

1.1标本采集

选取患者组为2013年11月至2014年5月本院门诊和入院就医的哮喘患者32例，哮喘的诊断符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制订的《 支气管哮喘防治指南》 的诊断标准[1]，其中男18例，女14例，年龄21-55岁，平均(33.2±10.4)且一个月内未使用糖皮质激素及其他免疫抑制剂。另选15例健康体检者作为对照组，两组在年龄、性别等一般临床资料方面无显著性差异(P>0.05)。

1.2主要试剂

异硫氰酸荧光素标记-抗人CD4单克隆抗体(FITC-CD4)、固定破膜剂IntraPrepTM购自美国Beckman公司；藻红蛋白标记-抗人IL-17单克隆抗体(PE-IL-17)、PE-IL-9及同型对照购自美国eBioscience公司；刺激剂PMA、离子霉素Ionomycin、莫能霉素monensin购自美国Sigma公司；IL-17 、IL-9的ELISA试剂盒购自美国R&D公司。

1.3标本采集和处理

受检者清晨空腹采血于肝素抗凝管中，其中一份密度梯度离心法分离外周血单核细胞(PBMCs)；另一份离心保留血清用于ELISA试验检测细胞因子。

1.4实验方法

1.4.1Th17细胞和Th9细胞的流式检测

用PBS溶液重悬分离好的外周血单核细胞，调整细胞浓度至1-2×106cells/ml，加入荧光素标记-CD4单抗，避光孵育20min，PBS洗涤后加入RPM1640培养体系(含刺激剂PMA50ng/ml、离子霉素1μg/ml、牛血清等)，放入37°温箱孵育18-20小时。孵育后的细胞进行固定破膜(按照说明书进行操作)，PBS洗涤后将细胞平均分成四份，分别加入PE-IL-17单抗、PE-IL-9单抗及同型对照，避光孵育30min，洗涤后应用流式细胞仪测定标记细胞的荧光强度。

1.4.2ELISA检测血清中IL-17和IL-9的含量

对于IL-17和IL-9的测定要严格按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.5数据处理

用SPSS19.0统计软件进行分析，数据以“均数±标准差”表示，两组间数据用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1支气管哮喘患者外周血Th17和Th9细胞的表达

与对照组相比，哮喘组患者外周血中Th17 和Th9细胞表达比例显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　　　　哮喘组与对照组患者外周血中Th17、Th9细胞

注：与对照组相比，*P<0.05

2.2支气管哮喘患者外周血IL-17、IL-9的表达水平

与对照组相比，哮喘组患者血清中IL-17和IL-9的浓度显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2　哮喘组与对照组血清中IL-17和IL-9的浓度

注：与对照组相比，*P<0.05

3讨论

支气管哮喘是一种病因尚未明确的气道慢性炎症，由多种致炎细胞参与如嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等，而CD4+T淋巴细胞在哮喘气道炎症中发挥重要的作用。

传统认为Th1/Th2细胞及细胞因子(IL-9)在哮喘的发病机制中起着重要的致病作用，Douwes[2]等发现约有一半的哮喘患者并未表现出Th2途径的应答特征，而且嗜酸粒细胞也没有明显升高，而另一半的哮喘患者的肺组织则以中性粒细胞浸润为主，因此认为IL-17具有强大的募集中性粒细胞的功能，其在哮喘发病中的作用也被广泛研究。然而，有学者提出Th17细胞本身并不能引起嗜酸性粒细胞性气道炎症，但却能增强Th2细胞介导的嗜酸性气道炎症[3]。本实验证实哮喘患者体内的Th17细胞及其细胞因子IL-17的分泌显著升高，与刘[4]等的研究结果相一致。Zhao等研究证实重症哮喘患者体内Th17细胞的表达及细胞因子IL-17、IL-22的水平显著的高于轻度和中度患者，说明Th17的水平和功能与哮喘的严重程度成正相关[5]，尤其是急性或重度哮喘患者的急性发作期和严重的气喘患者。

有学者指出Th17细胞分泌的IL-17可通过直接诱导IL-8的产生或者间接诱导粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和CXC趋化因子配体8(CXCL-8)来募集和活化中性粒细胞[6]。也有学者认为IL-17与受体结合后,主要通过活化MAP激酶,激活NF-κB的活性从而发挥IL-17的生物学活性，IL-17能作用于气道上皮、肺成纤维细胞和其他的炎症细胞从而引起促炎细胞因子、化学介质和金属基质蛋白酶的产生进而导致中性粒细胞及巨噬细胞的表达，进而引发组织炎症[7]。

过去人们一直认为IL-9属于Th2类细胞因子,可作用于多种炎症细胞和组织细胞,在哮喘中发挥着重要的作用[8]，直到以IL-9为主要分泌因子的Th9细胞被发现，Th9细胞及IL-9在哮喘发病中的作用才被广泛研究。哮喘患者支气管活检发现IL-9mRNA明显增高[9],在哮喘患者接触过敏原后，其肺泡灌洗液BAL中IL-9及IL-9mRNA的水平较正常对照组明显增加[10]。实验证实将Th9和Th2细胞分别过继到Rag2-/-小鼠体内，发现两者均可导致小鼠的哮喘症状的发生，但是Th9引发的哮喘比Th2的症状更严重，说明Th9细胞能够引发气道高反应性，嗜酸粒细胞增多，粘液分泌增多等[8,11]。动物实验证实，IL-4能介导B细胞分化产生IgE，而IL-9能够促进此过程，且IL-9能够促发T细胞和肥大细胞的增殖，进而加重过敏炎症反应[12]；不仅如此，IL-9可以促进嗜酸性粒细胞的成熟、嗜酸性粒细胞趋化因子的表达及支气管上皮细胞T细胞的分化成熟。此外，IL-9还可以作用于平滑肌细胞和气道上皮细胞等组织细胞,促进分泌促炎因子并出现大量的杯状细胞,分泌大量的黏液,在气道高反应性的发生发展中起了一定的作用[13]。

各种免疫细胞在微环境中能发挥着各自的功能维持免疫稳态，Th17与Th9细胞既相互共生又相互抑制，并且与其分泌的细胞因子在哮喘疾病病程中发挥重要作用。但是两种细胞之间存在怎么样的联系与哮喘的发生究竟有怎样的关系还需要进一步的研究。

参考文献：

[1]中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南(支气管哮喘的定义，诊断，治疗管理方案)[J].中华结核和呼吸杂志,2008,31(3):177.

[2]DouwesJ,GibsonP,PekkanenJ,etal.Non-eosinophilicasthma:importanceandpossiblemechanisms[J].Thorax,2002,57(7):643-648.

[3]HiroshiN,KoichiH.RoleofIL-23andTh17CellsinAirwayInflammationinAsthma[J].ImmuneNetwork,2010,10(1):1.

[4]刘泽宇,夏书月,王冉.哮喘患者外周血Th17细胞水平及功能的研究[J].重庆医学，2013，42(31):3766.

[5]YangZhao,JiongYang,Ya-dongGao,etal.Th17ImmunityinPatientswithAllergicAsthma[J].IntArchAllergyImmunol,2010,151(4):297.

[6]CosmiL,LiottaF,MaggiE,etal.Th17cells:newplayersinasthmapathogenesis[J].Allergy,2011,66(8):989.

[7]VanHamburgJP,AsmawidjajaPS,DavelaarN,etal.Th17cells,butnotTh1cells,frompatientswithearlyrheumatoidarthritisarepotentinducersofmatrixmetalloproteinasesandproinflammatorycytokinesuponsynovialfibroblastinteraction,includingautocrineinterleukin-17Aproduction[J].ArthritisRheum,2011,63(1):73.

[8]李志,杨婷婷,徐维家.Th17和Th9细胞与支气管哮喘病理机制研究的新进展[J].国际检验医学杂志,2013,34(12):1553.

[9]VockC,HauberHP,WegmannM.TheotherThelpercellsinasthmapathogenesis[J].Allergy,2010,doi:10.1155/2010/519298.

[10]YingS,MengQ,KayAB,etal.Elevatedexpressionofinterleukin- 9mRNAinthebronchialmucosaofatopicasthmaticsandallergen-inducedcutaneouslate-phasereaction:relationshipstoeosinophils,mastcellsandTlymphocytes[J].ClinExpAllergy,2002,32(6):866.

[11]StaudtV,BothurE,KleinM,etal.Interferonregulatoryfactor4isessentialforthedevelopmentalprogramofThelper9cells[J].Immunity,2010,33(2):192-202.

[12]XingJC,WuYZ,NiB.Th9:ANewPlayerinAsthmaPathogenesis[J].JournalofAsthma,2011,48(2):115.

[13]田洁,王胜军,许化溪.Th9细胞:一种新型效应性CD4+T细胞亚群[J].细胞与分子免疫学杂志,2009,25(9):853.

基金项目：大连市医药卫生科学研究项目(2012)

文章编号：1007-4287(2016)06-0949-03

中图分类号：R562.5

文献标识码：A

作者简介：李志(1971-)，男，硕士，主任技师，主要从事自身免疫及分子生物学研究。

(收稿日期：2014-11-28)

ResearchonthepopulationofTh17andTh9cellsandtheexpressionofthecytokinesinbronchialasthmapatients

LI Zhi1,YANG Ting-ting1,LI Wen-zhe2,et al.

(1.Department 0f Clinical Laboratory,Dalian Municipal Central Hospital,Dalian 116033,China;2.School of Basic Medical Sciences,Dalian Medical University,Dalian 116044,China)

Abstract:ObjectiveTo examine the proportion of peripheral of T helper cell 17(Thl7) and Th9 cells and the levels of interleukin 17(IL-17),IL-9 in bronchial asthma patients,and to discuss the role of Th17 and Th9 cells in the pathogenesis of asthma.MethodsFlow cytometric assay was used to analyse the percentages of Th17 and Th9 cells in patients and normal controls.The levels of IL-17 and IL-9 in plasma were measured by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Measured data were analyzed by using the statistical software SPSS19.0.ResultsThe percentages of Th17,Th9 cells and levels of IL-17,IL-9 in patients with asthma were significantly higher than that of normal controls(P<0.05).ConclusionTh17 and Th9 cells may play an important role in the pathogenesis of asthma.

Key words:Bronchial asthma;T helper 17;T helper 9;Interleukin 17;Interleukin 9