慢性应激大鼠海马DG区牛磺酸在空间学习记忆过程中的变化

张兆一，任美玲，杨　朋，李　静，吴建龙，陈静伊，金清华*

(延边大学医学院 1.2012级临床医学专业;2.2012级麻醉学专业;3.生理学与病理生理学教研室;4.2013级麻醉学专业，吉林 延吉133002)



慢性应激大鼠海马DG区牛磺酸在空间学习记忆过程中的变化

张兆一1，任美玲2，杨朋2，李静2，吴建龙3，陈静伊4，金清华3*

(延边大学医学院 1.2012级临床医学专业;2.2012级麻醉学专业;3.生理学与病理生理学教研室;4.2013级麻醉学专业，吉林 延吉133002)

摘要：目的观察海马齿状回(Dentate Gyrus,DG)区的牛磺酸(Taurine，Tau)在慢性应激模型大鼠空间学习记忆过程中的变化，初步探讨慢性应激影响大鼠空间学习记忆能力的部分机制。方法SD雄性大鼠16只，随机分为对照组和慢性应激组。以多种刺激随机应用的方法制备慢性应激大鼠模型，并利用脑部微量透析法和HPLC法实时观察慢性应激大鼠海马DG区细胞外液中Tau的含量。其次，利用Morris水迷宫(Morris Water Maze，MWM)观察大鼠的空间学习记忆能力，并观察海马DG区Tau含量在MWM训练过程中的变化。结果1)慢性应激组大鼠海马DG区细胞外液中的Tau含量明显高于对照组(P<0.05)。2)MWM的定位航行实验中，两组大鼠的逃避潜伏期均随着训练次数的增加而减少，而慢性应激组大鼠训练第4天的逃避潜伏期明显小于对照组(P<0.05)；MWM的空间探索实验中，慢性应激组的穿越原站台区次数显著多于对照组(P<0.05)。3)MWM训练过程中，慢性应激组大鼠海马DG区的Tau含量出现明显的增加(P<0.05)，而对照组大鼠海马DG区的Tau含量未出现明显变化(P>0.05)，两组间有显著性差异(P<0.05)。结论慢性应激可以提高大鼠的空间学习记忆能力，这可能与海马DG区的Tau含量增加有关。

关键词：慢性应激；海马齿状回；牛磺酸；空间学习和记忆；大鼠

(ChinJLabDiagn,2016,20:0871)

应激是机体对有害或有潜在威胁的体内外刺激所做出的非特异性防御反应，它在整体功能全面动员的基础上提高机体对有害刺激的耐受能力，减轻各种不良反应[1]。虽然应激对维持机体生命活动具有极其重要的意义，但持续而严重的应激会对机体产生负面影响，成为许多疾病的重要病因和诱因[1]，因此，关于应激对各种生理功能的作用及其机制的研究得到学术界普遍的关注。众所周知，学习记忆是机体改变自身行为或产生新行为以适应环境的必要过程，而海马在学习记忆，尤其在空间学习和记忆中扮演着重要的角色[2]。日常生活中人们所处的应激多数为慢性应激 (chronic stress,CS)，在CS的情况下，机体将加大对糖皮质激素的释放，而海马是血浆糖皮质激素作用的主要靶区[3]，研究报道，CS可导致海马神经元树突形态学的改变和抑制神经元的发生，进而影响海马依赖性的学习和记忆功能[4]。

哺乳动物的海马一般可分为CA1、CA3和齿状回(dentate gyrus,DG)等，这3个亚区在学习记忆过程中各自起不同作用，其中DG区是新信息进入海马的传入点，它把进来的信息进行编码和加工，对学习记忆至关重要[2]。本课题组先前的研究表明，海马DG区的天冬氨酸、谷氨酸(glutamate,Glu)和牛磺酸(taurine，Tau)在主动回避学习过程中明显增加[5]，而且黄芪改善大鼠学习记忆能力可能与DG区Tau增加相关[6]。Tau分布在大脑皮质、海马、小脑等脑区，可作为神经递质或调质起作用。虽然已有研究报道，CS可通过影响DG区神经再生而改变海马依赖性学习记忆功能[4]，但关于CS对海马DG区Tau的含量是否有影响未见报道。因此，本实验利用Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)观察CS大鼠空间学习记忆能力的过程中，利用脑部微量透析和HPLC法观察了DG区的Tau含量的变化。

1材料与方法

1.1实验动物和慢性应激模型的制备

16只健康雄性SD大鼠(体重为200±20 g)由延边大学医学部实验动物科提供)随机分成两个组，即对照组和CS组，每组各8只，均单笼饲养。应激刺激选用束缚2 h、夹尾1 min、冰水浴5 min、潮湿垫料24 h、噪音和足底电刺激。将上述6种刺激随机安排，每日1 种刺激，同种刺激不连续出现，共刺激30 d，使动物无法预料刺激。对照组大鼠自由饮食、摄水，整个实验过程中不接受任何刺激。

1.2海马DG区细胞外液中的Tau含量的测定

CS模型制备成功后第2天，大鼠进行腹腔麻醉(10%的水合氯醛，300 mg/kg)后固定于脑立体脑定位仪上，参考Paxinos和Watson大鼠脑图谱，将透析用外套管插入到DG上方1 mm处(定位坐标为前囟后3.4 mm ,正中线左2.2 mm,深 2.5 mm),并用牙托水泥固定于颅骨表面。术后第二天，在动物清醒状态下，通过透析用外套管将微量透析探针插入到DG区并固定在外套管上，探针超出外套管1.5 mm，其前端乙酸纤维素半透膜(DM-22，Eicom,日本)，可滤过分子量小于5×104的物质。微量透析探针和微量泵(ESP-64，日本Eicom公司)连接，灌流改良Ringer’s液(147 mM NaCl，4 mM KCl，2.3 mM CaCl2，pH 6.5)，流速为1.5 μl/min,稳定30 min后,用自动收集器收集微量透析样本,每管收集10 min,每次收集3个管,将其放入-80℃冰箱，以备测定Tau浓度。大鼠回笼饲养24 h后开始进行MWM训练，每天训练后，经透析探针收集海马DG区微量透析样本。

取12 μl的解冻后的样本，加入3 μl的OPA溶液(4 mM)，在室温下反应2.5 min,然后抽取10 μl反应液注入到生物活性物质微量分析系统 (HTEC-300，日本Eicom公司),通过其高效液相色谱分离柱和电化学检测器分析出Tau的含量。

1.3MWM实验

应用MWM进行空间学习和记忆能力的检测，包括定位航行和空间探索实验。定位航行实验时，水面高约45 cm，室温及水温均保持在22±2℃，站台(直径10 cm)任意放置于某一象限的中心位置并淹没于水面下约2 cm处；每只大鼠按东西南北4个入水点分别放入水池，每次游泳时限为120 s，若在120 s内大鼠找到并爬上站台，需让其在站台上站立5 s，若120 s以内未找到站台，需由测试者引领其找到并爬上站台，此时的潜伏期记录为120 s；每天训练1次，连续4 d。空间探索实验在MWM训练开始第5 d进行，除了撤去站台，其他条件不变，从同一个入水点将实验动物放入水中，测量它在120 s内穿越原站台区的次数。

1.4组织学鉴定

所有实验结束后，动物过量麻醉处死，取脑固定于10%的福尔马林溶液中，进行冠状面的冰冻切片(厚度约60 μm)、中性红染色，光学显微镜下确定透析探针的位置是否在海马DG区，透析探针没有进入DG区者不计入统计。

1.5统计学处理

2结果

2.1CS对大鼠海马DG区Tau含量的影响

CS组进行慢性应激刺激30 d后，每只大鼠收集三个管的海马DG区微量透析样本，高效液相色谱法测定每个管的Tau的含量，取平均值。结果显示，CS组海马DG区细胞外液中的Tau含量为1.39±0.24 μM，与对照组的0.41±0.09 μM相比，显著增加(P<0.05，图1)。

*P<0.05，与对照组相比。

2.2CS对大鼠的空间学习记忆能力的影响

两组大鼠在为期4 d的水迷宫定位航行训练中，随训练次数的增加，其逃避潜伏期均有不同程度的缩短：对照组大鼠训练第3和第4 d的逃避潜伏期分别为30.95±6.96 s、31.15±4.80 s,与第1 d(55.59±5.72 s)相比显著降低(均为P<0.05，图2)；CS组大鼠第3、第4 d的逃避潜伏期分别为20.22±4.70 s和17.14±2.84 s，与第1 d(44.97±8.29 s)相比显著降低(均为P<0.05，图2)。CS组大鼠第4 d的逃避潜伏期明显短于对照组(P<0.05，图2)，提示CS可促进大鼠的空间学习功能。

训练第5 d移除站台，进行空间探索实验，结果显示，慢性应激组120 s内穿越原平台区次数为11.00±5.36次，与对照组的5.17±1.94次相比，明显增加(P<0.05，图3)，提示CS可以提高大鼠的空间记忆能力。

2.3海马DG区Tau含量在大鼠空间学习记忆过程中的变化

为了探讨CS是否通过影响海马DG内的Tau含量来调节大鼠的空间学习记忆能力，本实验还观察了MWM训练过程中的DG区Tau含量的变化。在 MWM训练过程中，CS组大鼠海马DG区的Tau含量逐渐增加，训练第3 d和训练开始前相比有显著性差异(P<0.05)，其后逐渐回降，与之相比，对照组大鼠海马DG的Tau含量在训练过程中未出现明显变化(均为P>0.05)，两组间有显著性差异(P<0.05)(图4)。

#P<0.05，与第一天相比；*P<0.05，与对照组相比。

*P<0.05，与对照组相比。

以训练前的Tau含量作为100%，计算出每天训练后的Tau含量百分比。#P<0.05，与训练前相比；*P<0.05，与对照组相比。

图4海马DG区Tau含量在MWM训练过程中的变化

3讨论

应激是生活中不可避免的事件，人们为了适应日益强烈的竞争，需要承受来自不同方面的种种压力，常常处于应激，尤其是慢性应激(CS)状态，而由它引起的问题也随之而来。轻度的刺激多数情况下会提高个体的学习记忆能力，如果是刺激频率大、刺激时间延长或者刺激程度加强的CS则多会引发生理功能的异常。制备CS模型大鼠时用的刺激方法种类较多，常见的有：光照刺激、昼夜交替、无垫料或潮湿垫料、鼠笼震荡、鼠笼倾斜、冷热刺激、束缚刺激、电刺激、噪声刺激、禁食水等，根据CS相关文献[7]，以及本实验室的条件，我们选择束缚、夹尾、冰水浴、足底电击、噪音、潮湿垫料等六种刺激，每天随机给予一种刺激，共30 d，制备了慢性不可预见性应激模型，并利用MWM观察了这种CS对大鼠空间学习记忆能力的影响。本实验中CS组大鼠找到隐藏站台的逃避潜伏期明显缩短，而且撤去站台后120 s内穿越原站台区的次数显著增加，我们的实验结果提示CS可以提高大鼠的空间学习和记忆的能力。

学习和记忆是多种脑高级功能的基础，而海马在哺乳类动物学习和记忆的形成中扮演主要角色。文献报道，海马内的氨基酸类物质，如Glu、γ-氨基丁酸、甘氨酸、Tau等，参与海马的学习记忆功能的调节中[8]。如在前言所述，海马DG区在新信息的处理和编码中起关键作用[2]，而本课题组先前的研究证明，在大鼠的主动回避条反射过程中伴有DG内氨基酸类物质的增加[5]，且黄芪改善大鼠学习记忆能力可能与DG区Tau增加相关[6]。为探讨CS的改善空间学习记忆的作用是否与海马内的Tau有关，本实验利用脑部微量透析法和高效液相色谱法测定了海马DG区细胞外液中的Tau的含量。结果发现，CS可明显增加大鼠海马DG区Tau基础含量，同时也增强Tau在空间学习记忆过程中的反应。研究表明，Tau不仅促进学习记忆功能和神经系统的生长发育，而且还可通过抑制Glu活性来减轻脑缺血时的Glu的神经毒性作用[9,10]。另外，Tau对学习记忆的促进作用可能还与增加海马内Fos蛋白、β-内啡肽，加压素的含量有关[11，12]。因此，我们推测CS促进大鼠的空间学习记忆功能，可能与海马DG区Tau含量增加有关，但其具体的下游机制有待于进一步探究。

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[12]魏林郁，王宝英，李炳．牛磺酸对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响．现代医药卫生，2008，24(19)：2866.

基金项目：国家自然科学基金(31560278)；延边大学本科生科研项目(ydbksky201577)

*通讯作者

文章编号：1007-4287(2016)06-0871-04

中图分类号：Q427

文献标识码：A

作者简介：张兆一(1993-)，男，临床医学专业学生，研究方向为神经生理学。

(收稿日期：2016-01-15)

Change of taurine in hippocampal dentate gyrus during spatiallearning and memory in a rat model of chronic stress

ZHANGZhao-yi1,RENMei-ling2,YANGPeng2,etal.

(1.Grade2012StudentsMajorinClinicalMedicine;2.Grade2012StudentsMajorinAnaesthesia;3.DepartmentofPhysiologyandPathophysiology;4.Grade2013StudentsMajorinAnaesthesia,YanbianUniversityCollegeofMedicine,Yanji133002,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the changes of extracellular level of taurine (Tau) in the hippocampal dentate gyrus (DG) in a rat model of chronic stress during Morris water maze (MWM) test,and primarily investigate the neurochemical mechanism responsible for effect of chronic stress on spatial learning and memory.MethodsTotally 16 SD rats were randomly divided into two groups,control group and chronic stress (CS) group.The rat model of CS was prepared by random application of varied stressors,and then the extracellular concentration of Tau in the DG was determined by in vivo microdialysis and HPLC.Next,the spatial learning and memory abilities of rats were assessed by Morris water maze (MWM),and the extracellular concentration of Tau in the DG was simultaneously observed.Results1) Compared with the control group,the extracellular concentration of Tau in hippocampal DG was significantly increased in CS group (P<0.05).2) In the place navigation trial of MWM test,the escape latency decreased in both control and CS groups over the course of the training days,however,on the 4th day,escape latency was significantly shorter in CS group compared with control group (P<0.05); in the spatial prove trial of MWM test,the number of platform crossings was markedly increased in CS group compared with control group(P<0.05).3) During MWM test,Tau level in the DG was significantly increased in CS group (P<0.05),while it was not changed in control group(P>0.05).ConclusionChronic stress facilitates the spatial learning and memory in rats,which may be related to the increase of Tau in hippocampal DG region.

Key words:chronic stress; dentate gyrus;taurine;spatial learning and memory;rats