荠菜提取液对烟草青枯病菌的抑制作用

冯游滔，谢　燕，张　亚，廖晓兰*

(1.湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙410128；2.植物病虫害与防控湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128)



荠菜提取液对烟草青枯病菌的抑制作用

冯游滔1,2，谢燕1,2，张亚1,2，廖晓兰1,2*

(1.湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙410128；2.植物病虫害与防控湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128)

摘 要：采用无菌水、乙酸乙酯、无水乙醇、石油醚、丙酮、甲醇浸提荠菜干粉，通过室内毒力试验，分别考察荠菜提取液对烟草青枯病菌的抑制作用，结果仅有乙酸乙酯和无菌水荠菜提取液对烟草青枯病菌有抑菌活性，乙酸乙酯提取液抑菌率最高，为63.9％，无菌水提取液抑菌率为28.9％。通过透射电镜、麦法兰分度计比浊法、蒽酮比色法、考马斯亮蓝法分别考察荠菜无菌水和乙酸乙酯提取液对烟草青枯病菌形态、生长曲线、糖利用率及蛋白质含量的影响。电镜观察表明，经荠菜无菌水和乙酸乙酯提取液处理的烟草青枯病菌细胞膜和细胞壁的结构发生变化，菌体裂解。荠菜乙酸乙酯和水提取液能使烟草青枯病菌对数期滞后，糖利用能力降低，蛋白质含量增高。

关 键 词：荠菜提取液；烟草青枯病菌；抑制作用

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荠菜(Capsella bursa-pastoris)属十字花科荠菜属草本植物[1]。Tarle等[2]发现，荠菜中的芦丁对葡萄球菌(Staphylococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli )有较强的抑制作用；杨咏洁[3]证实，荠菜多糖对大肠杆菌、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus Rosenbach)、沙门氏菌(salmonella)都有一 定 的抑制效果；Saman Soleimanpour等[4]研究发现，荠菜和甘草的甲醇提取物对口腔致病菌有抑菌活性；Woo Jin Choi等[5]的研究表明，荠菜中的胡萝卜素能抗超级细菌。

烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的土传细菌性病害[6]，对烟草品质和效益影响极大[7]。防治烟草青枯病的方法主要包括轮作制、化学药剂防治、利用抗病品种防治和生物防治等[8–9]。近年来，植物源提取物防治烟草青枯病菌的报道较多，张汉千等[10]发现，大蒜乙醇和水提取物对烟草青枯病菌有抑制作用。赖荣泉等[11]利用大蒜的乙醇提取物进行大田试验，对烟草青枯病的防效最高可达 71.30％。许灵杰等[12]通过室内抑菌试验发现，竹醋液复合洋葱、鱼腥草提取物对烟草青枯病菌的抑制率均达到99％以上。姜雯婷等[13]发现，酒饼簕、许树和光叶巴豆的乙醇提取物对烟草青枯病菌的抑制效果较强。

为探讨荠菜防治烟草青枯病菌的潜力，笔者运用多种溶剂对荠菜干粉进行了提取，通过室内毒力试验，考察提取液对烟草青枯病菌的抑菌作用，运用透射电镜观察烟草青枯病菌菌体结构变化，并通过麦法兰分度计比浊法、蒽酮比色法、考马斯亮蓝法分别考察了荠菜无菌水和乙酸乙酯提取液对烟草青枯病菌形态、生长曲线、糖利用率及蛋白质含量的影响，以期为开发新型荠菜活性生防制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试荠菜购自蔬菜市场。整株洗净晒干，高速粉碎机粉碎备用。供试烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)由湖南农业大学生物安全检测中心提供。供试烟草湘烟3号由湖南农业大学中南烟草试验站提供。培养基为牛肉膏蛋白胨培养基(NA)[14]，pH7.0～7.2。

1.2 方法

1.2.1 荠菜活性物质的提取

参照夏日照等[15]的提取方法，用无菌水提取荠菜干粉，得膏状物，用无菌水溶解并定容至20 mL，获得荠菜水提液，4 ℃保存，备用。

同水提取法，分别用乙酸乙酯、无水乙醇、丙酮、石油醚和甲醇提取荠菜干粉，得膏状物，用无水乙醇溶解并定容至20 mL，分别获得荠菜乙酸乙酯、无水乙醇、丙酮、石油醚、甲醇提取液，4 ℃保存，备用。

1.2.2 烟草青枯病菌菌悬液制备及抑菌活性测定

将保存的烟草青枯病菌在NA培养基上进行活化，置于28 ℃培养箱中培养48 h，备用；接种当天，用接种环挑取适量菌体于无菌水中，用麦氏比浊管配制成3×108cfu/mL的菌悬液。

采用抑菌圈法[16]，注入荠菜不同溶剂提取液，测定对烟草青枯病菌的抑菌活性。

1.2.3 荠菜活性提取液对病原菌细胞形态影响的观察

在NA培养基中分别加入1 mL烟草青枯病菌悬液和2个经过灭菌的5 mm方形塑料小片，140 r/min，28 ℃振荡培养，24 h后加入400 µL荠菜水提液和乙酸乙酯提取液，继续振荡培养 8 h，取出塑料小片放入装有固定液的离心管中，经脱水、漂洗干燥等，进行扫描电镜观察。

1.2.4 荠菜提取液对烟草青枯病菌生长曲线、糖利用率、蛋白质含量的影响的测定

用麦法兰分度计比浊法[17]、蒽酮比色法[18]、考马斯亮蓝法[19]绘制细菌标准生长曲线、葡萄糖含量标准曲线和蛋白质含量标准曲线。分别加入200 µL荠菜无菌水和乙酸乙酯提取液，以加无菌水和乙醇溶液的菌液为对照，绘制烟草青枯病菌的生长图、含糖量的变化图和蛋白质含量的变化图。

1.3 数据处理

将数据导入DPS软件中分析显著性差异，使用Excel 2010绘图并分析。

2 结果与分析

2.1 荠菜不同溶剂提取液的抑菌效果

采用抑菌圈法，观察荠菜乙酸乙酯、无菌水、无水乙醇、丙酮、石油醚和甲醇提取液对烟草青枯病菌的抑菌效果，结果仅有乙酸乙酯和无菌水提取液对烟草青枯病菌有抑制作用(图1)，其余溶剂的提取液没有抑菌效果，说明溶剂会影响荠菜提取物的抑菌能力。荠菜乙酸乙酯提取液抑菌圈直径达40 mm，抑菌率达60％以上，荠菜无菌水提取液抑菌圈直径达18 mm，抑菌率为 28.9％，说明荠菜中具有抑菌活性的物质可能是脂溶性和水溶性的混合物，且脂溶性的抑菌物质能较充分地溶解在乙酸乙酯中。采用不同溶剂提取的有效抑菌成分可能不同。

图1　荠菜不同溶剂提取液的抑菌效果Fig .1 Inhibitory effects of different solvent extracts from Capsella bursa-pastoris on Ralstonia solanacearum

2.2 荠菜无菌水和乙酸乙酯提取液对烟草青枯病菌细胞形态的影响

图 2–A显示，对照组中烟草青枯病菌呈短杆状，两端钝圆，并且表面圆润、清晰、饱满，形状规则；菌体经乙醇溶液作用后，形态与正常菌体无明显差异(图2–B)。

图 2–C是经荠菜水提液处理后的烟草青枯病菌，与正常菌体相比，菌体形状不规则，表面粗糙，两端变形，菌体逐渐被溶解、破裂至死亡。图2–D是经荠菜乙酸乙酯提取液处理后的烟草青枯病菌，与正常菌体对比，菌体形状不规则，表面粗糙，破损严重，菌体从中间凹陷，发生裂解且即将断裂。

扫描电镜观察结果显示，荠菜无菌水和乙酸乙酯提取液处理，破坏了烟草青枯病菌的菌体结构，青枯菌菌体发生裂解。

A 正常生长的烟草青枯病菌；B 荠菜无菌水提液处理后的烟草青枯病菌；C 无水乙醇溶液作用下的烟草青枯病菌；D 荠菜乙酸乙酯提取液处理后的烟草青枯病菌。图2　烟草青枯病菌的扫描电镜观察结果Fig.2 SEM observation of Ralstonia solannacearum

2.3 荠菜提取液对烟草青枯病菌生长曲线、糖利用率和蛋白质含量的影响

图3显示，加入无水乙醇溶液的烟草青枯病菌菌液CK1和加入无菌水的菌液CK2的生长曲线基本一致，说明溶剂本身对菌液的生长曲线没有影响。

从变化趋势看，CK1、CK2和加入水提物、乙酸乙酯提取物处理的烟草青枯病菌的生长都呈上升趋势，但随着时间的变化，加入水提取物和乙酸乙酯提取物的菌液的生长曲线与CK1、CK2相比更为平缓，细菌生长对数期到达时期明显滞后于CK1、CK2。

综上所述，CK1、CK2的生长速率明显快于加入水提取物和乙酸乙酯提取物的菌液，说明荠菜水提取物和乙酸乙酯提取物对烟草青枯病菌的生长有较强的抑制作用，能抑制细菌的生长和分裂。

图3　荠菜乙酸乙酯和水提液处理的烟草青枯病菌生长曲线Fig.3 The growth curves of Ralstonia solannacearum treated by ethyl acetate extract and water extract from Capsella bursa-pastoris

图4显示，4组不同处理的菌液的含糖量均呈下降趋势，随着时间的变化，在细菌生长的各个时期，CK1和 CK2的菌液含糖量明显高于加入荠菜水提液、乙酸乙酯提取液处理的烟草青枯病菌菌液。

图4　荠菜乙酸乙酯和水提液处理的烟草青枯病菌的含糖量Fig.4 The sugar contents of Ralstonia solannacearum treated by ethyl acetate extract and water extract from Capsella bursa-pastoris

综上所述，加入荠菜水提液和乙酸乙酯提取液处理的烟草青枯病菌在生长过程中，对糖的利用率降低，可能是由于荠菜提取液具有抑菌作用，抑制细菌的生长和分裂，导致了细菌生长过程中糖的利用率降低。

随着处理时间的增加，CK1、CK2菌液的蛋白质含量不断降低，而加入荠菜水提液、乙酸乙酯提取液处理的菌液蛋白质含量先后逐渐增加。这是由于随着作用时间的不断延长，荠菜水提液和乙酸乙酯提取液破坏了菌体，致使细菌细胞质泄入菌液中，使得处理菌液中蛋白质含量增加的缘故。

图5　荠菜乙酸乙酯和水提液处理的烟草青枯病菌的蛋白质含量Fig.5 The protein contents of Ralstonia solannacearum treated by ethyl acetate extract and water extract from Capsella bursa-pastoris

3 讨论

采用6种溶剂提取荠菜活性物质，仅无菌水与乙酸乙酯提取液表现出了抑菌活性，表明溶剂的选择与活性的表达相关，因此，需进一步筛选最佳溶剂。无菌水与乙酸乙酯的提取液均表现出了抑菌活性，表明活性物质既有水溶性的，也有脂溶性的，这为荠菜活性物质进一步分离纯化提供了参考。荠菜无菌水和乙酸乙酯提取液处理的烟草青枯病菌细胞膜和细胞壁的结构发生变化，菌体裂解，生长对数期滞后，糖利用能力降低，蛋白质含量增高，这些发现初步表明荠菜提取液具有抑菌功效，其抑菌机理还需进一步研究。

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责任编辑：罗慧敏

英文编辑：罗 维

Inhibition activity of Capsella bursa-pastoris extracts against Ralstonia solanacearum

Feng Youtao1,2, Xie Yan1,2, Zhang Ya1,2, Liao Xiaolan1,2*
(1.College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests, Changsha 410128, China)

Abstract:Water, ethyl acetate, anhydrous ethanol and petroleum ether, acetone, methanol were used to extract Capsella bursa-pastoris powder, the inhibitory effects of 6 kinds of solvent extracts on Ralstonia solanacearum were investigated through indoor virulence test , the results showed that only ethyl acetate and water extracts from Capsella bursa-pastoris had antimicrobial activity on Ralstonia solanacearum , the of ethyl acetate extract reached 63.9％, and antibacterial rate of water extract was 28.9％. The influences of water and ethyl acetate extracts on morphology, growth curve,utilization rate of sugar and protein content of Ralstonia solanacearum were investigated by transmission electron microscopy (SEM), wheat flange dividing turbidimetry, anthrone colorimetry, coomassie brilliant blue method .Electron microscopy showed that the structures of cell membrane and cell wall were changed and the bacteria cracked in Ralstonia solanacearum treated with water extract and ethyl acetate extract from Capsella bursa-pastorisof . Ethyl acetate extract and water extract from Capsella bursa-pastoris can make Ralstonia solanacearum logarithmic phase lag, reduce sugar utilization, and increase protein content in Ralstonia solanacearum.

Keywords:Capsella bursa-pastoris extracts; Ralstonia solanacearum; inhibition

中图分类号：S435.72

文献标志码：A

文章编号：1007−1032(2016)03−0312−05

收稿日期：2016–03–10 修回日期：2016–04–06

基金项目：公益性行业(农业)科研专项(201303025)

作者简介：冯游滔(1990—)，男，湖南汨罗人，硕士研究生，主要从事植物病害生物防治研究，971820275@qq.com；*通信作者，廖晓兰，博士，教授，主要从事生防资源的挖掘与利用研究， liaoxl88@126.com