Mistic融合蛋白促进ω-3脂肪酸去饱和酶Fat-1在大肠埃希菌中高效表达*

赵　艳，柳欣欣，王大新，李湘鸣，陈　平，王　昊

(1.扬州大学临床医学院江苏省苏北人民医院医学实验研究中心，江苏扬州 225001；2.扬州大学临床医学院江苏省苏北人民医院普外科，江苏扬州 225001；3.扬州大学医学院，江苏扬州　225001)



Mistic融合蛋白促进ω-3脂肪酸去饱和酶Fat-1在大肠埃希菌中高效表达*

赵艳1，柳欣欣2△，王大新1，李湘鸣3，陈平2，王昊2

(1.扬州大学临床医学院江苏省苏北人民医院医学实验研究中心，江苏扬州 225001；2.扬州大学临床医学院江苏省苏北人民医院普外科，江苏扬州 225001；3.扬州大学医学院，江苏扬州225001)

[摘要]目的构建真核膜蛋白ω-3 脂肪酸去饱和酶Fat-1基因在大肠埃希菌中的高效表达质粒。方法利用分子克隆技术构建携带Fat-1基因的重组原核表达质粒pET32a-Fat-1和插入膜蛋白表达分子伴侣Mistic基因的pET32a-Mistic-Fat-1；将两种重组质粒转化大肠埃希菌株BL21(DE3)，IPTG诱导表达Fat-1蛋白和M110-Fat-1蛋白，通过十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)灰度分析其表达量，蛋白免疫印迹法(Western blot)进一步鉴定蛋白表达。结果经酶切鉴定和测序证实成功构建了pET32a-Fat-1和pET32a-Mistic-Fat-1原核表达载体；SDS-PAGE和Western blot证实ω-3脂肪酸去饱和酶Fat-1在原核表达系统中没有明显诱导表达，而M110-Fat-1融合蛋白在大肠埃希菌中获得了高效表达，占全细胞蛋白总量的15%。结论ω-3脂肪酸去饱和酶Fat-1基因与Mistic基因融合表达，实现了在原核宿主中高效表达真核膜整合蛋白ω-3脂肪酸去饱和酶Fat-1。

[关键词]Mistic；ω-3脂肪酸去饱和酶Fat-1基因；膜蛋白；高效表达

ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 PUFA)有提供能量、降脂、抗炎、防癌及抑制肿瘤等有益作用，而ω-6多不饱和脂肪酸(ω-6 PUFA)在很多方面则具有相反的不利影响，如促炎、促肿瘤增殖等有害作用，补充ω-3 PUFA并减少ω-6 PUFA的摄入已成为广泛共识。ω-3脂肪酸去饱和酶是ω-6 PUFA转化为ω-3 PUFA的关键酶，来自于线虫的脂肪酸去饱和酶fat-1基因，可以在18～20碳的不饱和脂肪酸的烃链中添加一个双键，将ω-6脂肪酸变为ω-3脂肪酸[1-2]。而哺乳动物体内缺乏这种酶，不能自然通过ω-6脂肪酸来产生ω-3脂肪酸，必须依靠饮食补充来源。随着对脂肪酸代谢在基因水平的不断深入认识和研究,通过基因工程及转基因技术获取大量ω-3 PUFA以满足人们的需求已成为研究的热点。

本研究拟用分子生物学技术构建原核表达载体，使Fat-1基因在大肠埃希菌中高效表达。由于ω-3脂肪酸去饱和酶是一种真核跨膜蛋白，在原核系统表达外源性膜蛋白有其不兼容性，有文献报道其在原核系统中表达效率低[3]。本研究经过文献检索,尝试引入Mistic基因(NCBI序列号:NC_000964.3)作为分子伴侣，Mistic基因最初在枯草芽孢杆菌中发现，是一种细菌膜结合蛋白，编码的蛋白是M110由110个氨基酸组成，它可以提高真核细胞膜蛋白在细菌细胞膜上的表达[4-6]。本研究设计将ω-3 脂肪酸去饱和酶Fat-1基因与Mistic基因融合表达，大大提高了ω-3 脂肪酸去饱和酶表达效率，为进一步开展ω-3脂肪酸去饱和酶的体外酶学研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料原核表达载体pET32a、菌株大肠埃希菌DH5α、大肠埃希菌 BL21(DE3)均由本室保存； Fat-1基因质粒由上海交通大学吴际教授馈赠。Mistic基因由金唯智生物技术有限公司合成；Hind Ⅲ和EcorⅠ购自Fermentas公司；T4连接酶购自本TaKaRa公司；DNA marker、Phanta®Super-Fidelity DNA聚合酶、ClonExpress®MuitiS One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司；蛋白Maker及蛋白电泳试剂购自碧云天生物技术公司；质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒和PCR纯化试剂盒购自Axygen公司；酵母粉和胰蛋白胨购自英国Oxoid公司；PCR引物合成及测序由华大基因公司完成；其他均为国产分析纯生化试剂。

1.2方法

1.2.1pET32a-Fat-1表达质粒的构建以测序正确的Fat-1质粒为模板，根据已测得的全长序列设计引物，进行PCR扩增。上游引物为：5′-CGG AAT TCA TGG TCG CTC ATT CCA GCG AAG -3′，其中导入EcorⅠ酶切位点；下游引物序列为：5′-CCC AAG CTT TCA CTT GGC CTT TGC CTT CTC -3′，其中导入HindⅢ酶切位点。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳回收， EcorⅠ和HindⅢ酶切pET32a载体和PCR产物，T4连接酶连接，转化DH5α感受态细胞。挑取单个克隆于5ml LB(Amp+)培养液中培养过夜，提取重组质粒， EcorⅠ/HindⅢ酶切鉴定，阳性克隆提交华大基因公司进行测序分析，见表1。

1.2.2pET32a-Mistic-Fat-1表达质粒的构建以测序正确的pUC57-Mistic质粒为模板,根据Mistic的5′序列和载体pET32a上的酶切位点EcorⅠ及上游序列设计P1，根据Mistic的3′端序列和Fat-1的5′端序列设计引物P2，PCR扩增得到全长Mistic基因；以测序正确的Fat-1质粒为模板，根据Fat-1基因5′端序列设计上游引物P3，根据Fat-13′端序列和载体上的HindⅢ酶切位点及下游序列设计下游引物P4，PCR扩增得到全长Fat-1基因。EcorⅠ和HindⅢ酶切pET32a载体，将载体和两种PCR产物按比例混合，由重组酶Exnase®MultiS催化重组反应，产物转化DH5α感受态细胞。挑取单个克隆于5 mL LB(Amp+)培养液中培养过夜，提取重组质粒，EcorⅠ/HindⅢ酶切鉴定，阳性克隆提交华大基因公司进行测序分析。

表1　本研究中所用的引物

1.2.3菌体中表达产物的诱导表达及SDS-PAGE鉴定将经鉴定的原核重组表达质粒转化宿主菌BL21(DE3)，涂布于含有相应抗生素的LB琼脂培养板上，37 ℃培养10～16 h。挑选单个菌落接种到含抗生素的5 mL LB管中，与37 ℃剧烈摇动培养8～12 h。取上述培养物按1∶100的比例接种到含抗生素的5 mL新鲜LB管中，37 ℃剧烈摇动培养4 h，使菌液光密度(OD)550达到0.6～0.8时，在转接管中加入终浓度为0.1、0.3、0.5、0.8和1.0 mmol/L IPTG，30 ℃剧烈摇动，继续培养4 h，对照管为未诱导的对照菌。分别用1．5 mL离心管收集培养液各约1 mL，12 000 r/min，离心1 min，收集菌体。菌体沉淀以100 μL 磷酸盐缓冲液(PBS)重悬浮混匀，取10 μL加5×SDS-PAGE上样buffer，于100 ℃煮沸10 min，进行SDS-PAGE。0．25%考马斯亮蓝R250染液染胶2 h，脱色液(30%甲醇，10%乙酸)脱色至蛋白带清晰可见时，分析蛋白质诱导表达结果。同样方法改变诱导温度和时间，分析蛋白诱导表达情况。

1.2.4蛋白免疫印迹法(Western blot)鉴定融合蛋白对含pET32a-Fat-1和pET32a-Mistic-Fat-1重组质粒的BL21(DE3)工程菌IPTG 0.3 mmol/L诱导6 h后的表达产物进行Western blot分析，以未诱导菌表达产物为对照。加入小鼠抗His-tag单克隆抗体(1∶1 000)孵育过夜,TBS-T充分洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG作二抗(1∶1 000),孵育1 h，TBS-T充分洗涤，ECL显影。

2结果

2.1Fat-1基因的生物信息学分析Fat-1基因最早发现源于线虫， 编码ω-3脂肪酸去饱和酶。Fat-1基因cDNA全长1 209 bp，翻译产物是由402个氨基酸组成，相对分子质量约为46．4×103。对蛋白质序列进行跨膜区预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMH MM) 表明ω-3脂肪酸去饱和酶是1种有3个跨膜结构的膜蛋白，N末端可能位于胞外，C末端位于胞内。见图1。

图1　Fat-1蛋白跨膜区预测

2.2pET32a-Fat-1原核表达质粒的鉴定PCR扩增获得大小为1 206 bp的片段,将该片段连入表达载体,构建pET32a-Fat-1 重组质粒,经EcorⅠ和HindⅢ双酶切阳性克隆获得与理论值相符的目的条带(图2) 。测序结果表明，Fat-1 cDNA序列为密码子优化的Fat-1基因，翻译的氨基酸序列与公布序列完全一致。

A： M为Marker，1为Fat-1基因PCR产物；B： M为Marker，1为pET32a-Fat-1质粒EcorⅠ和HindⅢ双酶切产物。

图2pET32a-Fat-1重组质粒构建电泳

2.3pET32a-Mistic-Fat-1原核表达质粒的鉴定PCR扩增获得大小为1 206 bp的Fat-1片段和330 bp的Mistic片段,将两个片段无缝拼接重组连入表达载体。构建的pET32a-Mistic-Fat-1 重组质粒,经EcorⅠ/HindⅢ双酶切阳性克隆获得2条与理论值相符的1 536 bp的目的片段和载体片段(图3)。DNA测序证明插入序列是目的序列，且与融合表达载体的读码框相符。

M：Marker；1：pET32a-Mistic-Fat-1质粒EcorⅠ和HindⅢ双酶切产物。

图3pET32a-Mistic-Fat-1重组质粒酶切鉴定图

2.4重组蛋白Fat-1在大肠埃希菌BL21中的诱导表达转化pET32a-Fat-1重组质粒的BL21不同浓度 IPTG诱导后，SDS-PAGE结果显示，预期在相对分子质量约64×103的位置上出现诱导的蛋白条带，但是与对照组相比并没有明显增亮的条带，见图4。

M：蛋白Marker条带及相对分子质量；1～6：未诱导组与不同浓度IPTG诱导组(0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L)的全细胞。

图4Fat-1蛋白诱导表达10%SDS-PAGE

M：蛋白Marker条带及相对分子质量；1～6：未诱导组与不同浓度IPTG诱导组(0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L)的全细胞。

图5M110-Fat-1蛋白诱导表达8%SDS-PAGE

2.5重组蛋白M110-Fat-1在大肠埃希菌BL21中的诱导表达转化pET32a-Mistic-Fat-1重组质粒的BL21在不同浓度IPTG诱导后，SDS-PAGE结果显示，与未诱导的对照组相比，在相对分子质量约为78×103的位置上出现一条较浓集带(图5)，说明插入的融合基因已经在大肠埃希菌中表达。重组蛋白在30 ℃，0.3 mmol/L IPTG诱导6 h后表达量较高，灰度扫描分析占全细胞总蛋白的15%，见图6。

M：蛋白Marker条带及相对分子质量；1：未诱导组全细胞；2：0.3 mmol/L IPTG，30 ℃诱导6 h全细胞；3： 0.3 mmol/L IPTG，25 ℃诱导16 h全细胞；4：0.3 mmol/L IPTG，20 ℃诱导20 h全细胞。

图6M110-Fat-1蛋白诱导表达8%SDS-PAGE

2．6Western blot检测用抗His-tag单克隆抗体对Fat-1和Mistic-Fat-1融合蛋白进行Western blot检测。抗His-tag的抗体可以检测到相对分子质量约为78×103的Mistic-Fat-1融合蛋白高效表达条带，而Fat-1融合蛋白在相对分子质量约64×103的位置上出现了较弱的诱导蛋白条带，见图7。

1,2:未诱导与诱导的含pET32a-Fat-1和重组质粒的表达产物;3,4:未诱导与诱导的含pET32a-Mistic-Fat-1重组质粒的表达产物。

图7Western blot检测

3讨论

本文通过将ω-3 脂肪酸去饱和酶Fat-1基因与Mistic基因融合表达，实现了在原核宿主中高效表达真核膜蛋白ω-3质粒脂肪酸去饱和酶。在原核系统表达外源性真核膜蛋白有其不兼容性，在真核系统表达有利于其活性的发挥，但是相对昂贵，与Mistic蛋白融合高效表达外源性真核膜蛋白提供了一种相对简单并且廉价的方法。在大肠埃希菌中单独表达Fat-1基因时其产量很低，原因可能是膜蛋白在大肠埃希菌中过度表达，暴露的疏水性靶向信号超出了信号识别颗粒，大肠埃希菌易位复合子过饱和，进一步导致膜蛋白表达被抑制[7]。

Mistic是一种在枯草芽孢杆菌中发现的膜整合蛋白，2005年Roosild等[8]首次报道了Mistic蛋白的溶解结构，并且预测它作为伴侣与目的蛋白N-末端融合表达，可以提高外源性膜蛋白在大肠埃希菌中的表达水平。国内外有文献报道它作为伴侣分子辅助了组氨酸激酶受体、叶绿体ATP/ADP转运体、G蛋白偶联受体、盐藻八氢番茄红素脱氢酶等多种真核膜蛋白分子的高效表达[7,9-11]。有研究表明，Mistic蛋白单独表达或融合表达时都缺乏信号识别序列，过表达无明显组织毒性，它的合成和转运到细胞膜有可能绕过大肠埃希菌易位子复合体[8]。Mistic有紧凑的4个α螺旋结构，不同于其他膜蛋白，这4个螺旋结构并不形成疏水跨膜部分，它的表面富有极性和带电残基，有特殊的表面亲水性质，是这种表面极性而不是疏水性促使它与细胞膜结合紧密，对膜蛋白在大肠埃希菌中的表达起到强大的促进作用，并增加其溶解性[12]。

去饱和酶均是多次跨膜的固有膜蛋白，他们的过量表达即是进行相关研究的第一步，也是最大的瓶颈之一。本文利用遗传工具成熟的大肠埃希菌表达系统，结合与Mistic的融合表达，成功过量表达了ω-3脂肪酸去饱和酶，实现分子生物学意义上的过量表达。此研究结果为进一步对跨膜型脂肪酸去饱和酶的结构和功能研究奠定基础,为改造出一个高活性的ω-3脂肪酸去饱和酶的研究奠定基础。在原核宿主中重组高效表达ω-3脂肪酸去饱和酶，作用于18～20碳的脂肪酸底物，有效将ω-6脂肪酸转变为ω-3脂肪酸，具有重要的医学和营养学价值。

参考文献

[1]华晓敏，陈俏俏，潘庆杰．Fat-1基因及其功能的研究进展[J]．青岛农业大学学报(自然科学版)，2012(1)：41-47．

[2]杨慧婷，王洪梅，方永志，等．Fat-1转基因动物研究进展[J]．生物技术通报，2012(12)：8-12．

[3]元冬娟，吴湃，熊继红，等．蓖麻和线虫的两种不同结构脂肪酸去饱和酶的原核表达[J]．生物技术通报，2008(S1)：393-396．

[4]Xu Y,Kong J,Kong W.Improved membrane protein expression in lactococcus lactis by fusion to mistic[J].Microbiology,2013(159):1002-1009.

[5]Lee KA,Lee SS,Kim SY,et al.Mistic-fused expression of algal rhodopsins in Escherichia coli and its photochemical properties[J].Biochim Biophys Acta,2015,1850(9):1694-1703.

[6]Gong Z,Kessans SA,Song L,et al.Recombinant expression,purification,and biophysical characterization of the transmembrane and membrane proximal domains of HIV-1 gp41[J].Protein Sci,2014,23(11):1607-1618.

[7]Kefala G,Kwiatkowski W,Esquivies L,et al.Application of mistic to improving the expression and membrane integration of histidine kinase receptors from escherichia coli[J].J Struct Funct Genomics,2007,8(4):167-172.

[8]Roosild TP,Greenwald J,Vega M,et al.NMR structure of Mistic,a membrane-integrating protein for membrane protein expression[J].Science,2005,307(5713):1317-1321.

[9]Deniaud A,Bernaudat F,Frelet-Barrand A,et al.Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E.coli membranes:behind the Mistic strategy[J].Biochim Biophys Acta,2011,1808(8):2059-2066.

[10]Marino J,Bordag N,Keller S,et al.Mistic′s membrane association and its assistance in overexpression of a human GPCR are independent processes[J].Protein Sci,2015,24(1):38-48.

[11]周峰，黄非，白林含．盐藻PDS基因的同源克隆及在大肠杆菌中的表达[J]．微生物学报，2015，55(2)：149-155．

[12]Broecker J,Fiedler S,Gimpl K,et al.Polar interactions trump hydrophobicity in stabilizing the self-inserting membrane protein Mistic[J].J Am Chem Soc,2014,136(39):13761-13768.

Fusion to Mistic improved fatty acid desaturase Fat-1 overexpression in E.coli*

Zhao Yan1,Liu Xinxin2△,Wang Daxin1,Li Xiangming3,Chen Ping2,Wang Hao2

(1.MedicalResearchCenter,NorthernJiangsuPeople′sHospitalClinicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu225001,China;2.DepartmentofGeneralSurgery,NorthernJiangsuPeople′sHospitalClinicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu225001,China;3.MedicalCollege,YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu225001,China)

[Abstract]ObjectiveTo construct a highly efficient expression plasmid of eukaryotic nuclear membrane protein Omega 3 fatty acid desaturase gene Fat-1 in E.coli.MethodsUsing molecular cloning technology to construct the recombinant prokaryotic expression plasmid pET32a Fat-1 and pET32a-Mistic-Fat-1 fused with Membrane proteins expression chaperon mistic;the two recombinant plasmids were transformed into E.coli strain BL21 (DE3),the expression of Fat-1 protein and M110 Fat-1 protein induced by IPTG were identified by SDS-PAGE and gray degree analysed the amount of expression,further identified by Western blot.ResultsThe results of enzyme digestion and sequencing demonstrated that we successfully constructed the prokaryotic expression vectors pET32a Fat-1 and pET32a-Mistic-Fat-1;SDS-PAGE and Western blot showed that Fat-1 fatty acid desaturase wasn′t significantly induced,but the overexpression of M110 Fat-1 fusion protein was obtained in E.coli,accounting for 15% of the total amount of whole cell proteins.ConclusionThe fusion with Mistic proteins to express the Fat-1 gene has realized the overexpression of eukaryotic nuclear membrane integrated protein Omega 3 fatty acid desaturase in prokaryotic host.

[Key words]Mistic;ω-3 fatty acid desaturase Fat-1;membrane protein;overexpression

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.010

*基金项目：国家自然科学基金资助项目(81300721)；扬州市科技计划项目(YZ2014204)。

作者简介：赵艳(1982-)，主管技师，硕士，主要从事医学检验和临床营养研究。△通讯作者，Tel:18051061376；E-mail:gorilla1999@hotmail.com。

[中图分类号]R34

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)16-2190-04

(收稿日期：2015-11-30修回日期：2016-02-16)