贵阳地区2013年手足口病非EV71、非CVA16型肠道病毒的检测分析*

杨兴林，梁跃东，洪章萍，熊金凤，王云芬，黄　海

(1.贵州省贵阳市第五人民医院检验科　550004；2.贵阳医学院检验系,贵阳 550004)



贵阳地区2013年手足口病非EV71、非CVA16型肠道病毒的检测分析*

杨兴林1，梁跃东1，洪章萍1，熊金凤1，王云芬1，黄海2

(1.贵州省贵阳市第五人民医院检验科550004；2.贵阳医学院检验系,贵阳 550004)

[摘要]目的了解贵阳地区引起手足口病(HFMD)的非肠道病毒71型(EV71)、非柯萨奇病毒A(CVA)16型肠道病毒的病原构成及优势型别，为贵阳地区HFMD防治工作提供依据。方法收集2013年4～6月检测为非EV71、非CVA16型肠道病毒的HFMD患者肛拭子标本共107例。提取病毒核酸，用巢式RT-PCR法扩增病毒VP4区序列，对PCR阳性扩增产物进行测序，通过与GenBank收录的序列BLAST比对确定病毒型别；并对优势型别进行序列和进化分析。结果107例标本中共有100例标本巢式RT-PCR检测为阳性(93%)，其中100例PCR产物测序成功，经BLAST比对后，100例标本病毒型别均得到确定：CVA6为46例，CVA10为30例，CVA5为10例，CVA2为6例，CVA3和CVA4各2例，CVB2和ECHO16各2例。CVA6在型别确定的非EV71、非CVA16型肠道病毒中占42.99%，为优势肠道病毒型别。结论贵阳地区引起HFMD的肠道病毒型别多样，CVA6为非EV71、非CVA16型肠道病毒中的优势型别。

[关键词]手足口病；肠道病毒；基因型

手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)主要由肠道病毒(enteroviruses,EV) 引起的出疹发热急性传染病，引起HFMD的病毒属于小RNA病毒科EV属，引发HFMD 的有20多个血清型，包括柯萨奇病毒A组(CVAsckievirus A,CVA)的2、4、5、7、9、10、16 型等，B组(CVAsckievirus B,CVB)的1、2、3、4、5 型等；EV71型(human enterovirus 71,EV71)；埃可病毒(echovirus,ECHO)等。其中以EV71及CVA16型较为常见。尽管非EV71型非CVA16型EV在HFMD病原谱中占一定比例，但目前对其构成和分子流行病学特征尚不清楚。HFMD的疫情有传播快、易于流行的特点，但仍以轻型普通病例为主，HFMD常规病原学检测主要用实时荧光定量PCR(RT-PCR)对EV通用型、EV71型和CVA16型核酸进行检测，对于引起HFMD的其他型别EV的病原构成其报道较少，不同地区病原构成其分布情况也有不同。

对2011年4～10月在贵阳市第五人民医院住院期间临床诊断为HFMD病例采集肛拭子标本1 379 份运用RT-PCR检出率分别为EV通用型46.99%，EV71型5.80%，EV71 和柯萨奇病毒A16型2.18%[1]。2012年的检测数据同样以EV通用型，说明本地区其HFMD原主要以其他型EV为主。为进一步了解贵阳地区引起HFMD的非EV71、非CVA16型EV的病原构成，笔者针对EV VP4区设计的一套分型引物进行RT-PCR，通过测序和序列比对分析对2013年4～6月其他型EV进行型别鉴定，现将结果报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料收集2013年4月1日至6月30日，在贵阳市第五人民医院(贵阳市HFMD的定点医院)感染科住院治疗的HFMD患儿1 410例，年龄1个月至15岁，其中，男876例、女534例。诊断标准参照均符合《诸福棠实用儿科学》HFMD诊断标准及《手足口病诊疗指南》(2010年版)HFMD的诊断标准。

1.2方法

1.2.1标本的采集在患儿住院当天用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后,迅速将棉签放入病毒采样管(北京友康基业生物科技有限公司)中，采样管外表贴上带有惟一识别号码的标签。于2 h内送实验室，-20 ℃低温保存，2 d内用RT-PCR检测EV通用型、EV71、CVA16核酸，对EV通用型阳性、EV71核酸阴性、CVA16核酸阴性的标本-80 ℃低温保存。

1.2.2EV核酸PCR荧光检测采用上海之江生物科技有限公司生产的EV71、 CVA16 RT-PCR试剂和EV通用型RT-PCR试剂。EV通用型包括柯萨奇病毒A组4、5、6、7、9、10、16型，柯萨奇病毒B组2、5、13型，埃可病毒和EV71型特异性核酸片段，EV71型只含 EV71的特异性RNA核酸片段，CVA16型只对16型特异性RNA核酸片段，采用一步法RT-PCR技术结合荧光探针技术进行检测。病毒 RNA 的提取，采用磁珠柱提取法，按照上海之江生物科技有限公司RNA抽提试剂盒说明书操作。扩增反应体系和条件按照说明书操作和设置，在罗氏Cobas′z 480 RT-PCR仪上进行检测。荧光通道检测选择：选用FAM通道。结果判断：按照说明书，检测Ct≤38，检测结果报告为阳性；检测Ct值在38～40，重复检测1次，如果重复检测Ct值仍在38～40，则判为阴性。EV通用型试剂检测为阳性而EV71和CVA16特异性试剂检测为阴性的标本，则判为其他血清型EV阳性。对判为其他血清型肠道通用阳性的标本(非16、71型)，用上海之江生物科技有限公司生产CVA6型核酸测定检测试剂、CVA10型核酸测定检测试剂检测，对其筛查阴性样本进行如下方法测序鉴定。

1.2.3其他血清型EV检测采用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂盒,按照说明书操作从140 μL肛拭子病毒保存液提取RNA,提取的RNA最终溶解在50 μL无菌无核酸酶水中备用。参考Ishiko等[2]针对EV VP4区设计的一套分型引物进行RT-PCR。以OL68-1/MD91为引物，按OneStep RT-PCR Kit(购自QIAGEN公司)说明书配制第1轮PCR体系，反应条件如下： 50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40个循环；72 ℃ 10 min。取第1轮PCR产物5 μL，以OL68-1/EVP4为引物，进行第2轮PCR，反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ lrain，40个循环；72 ℃延伸10 min。其他血清型EV检测引物序列见表1。得到的PCR产物经1% TAE 琼脂糖凝胶电泳。PCR阳性产物送北京诺赛基因公司切胶纯化回收后测序。将测序结果与GenBank中的EV核苷酸序列进行BLAST比对，确定病毒型别。

表1　其他血清型EV检测引物序列

2结果

2.1临床EV RT-PCR检测结果在1 410例临床标本中，EV通用型的阳性为702例，检出率为49.79%。其中EV71 75例，占5.32%；CVA16阳性73例，占5.18%；EV71与CVA16同时阳性2例，占0.14%，其他血清型EV552例，占39.15%，分布比例见表2，检测EV部分标本荧光RT-PCR曲线见图1。

表2　1 410例标本PCR荧光检测EV结果

图1　EV通用型RT-PCR检测

图2　电泳图

EV型别阳性数(n)检出率(%)(阳性/标本总数,n/n)CVA64642.99(46/107)CVA103028.04(30/107)CVA265.61(6/107)CVA321.87(2/107)CVA421.87(2/107)CVA5109.35(10/107)CVB221.87(2/107)ECHO1621.87(2/107)无扩增76.54(7/107)总计107100.00(107/107)

2.2其他型EV的检测结果在RT-PCR检测EV通用型阳性，而EV71和CVA16检测阴性的标本1 410例样本中，抽取107例样本，用RT-PCR法进行CVA6、CVA10检测，对CVA6、CVA10检测性样本用EVVP4区设计的一套分型引物进行RT-PCR，PCR产物测序结果与GenBank EV核苷酸序列经BLAST比对。107例标本病毒型别得到结果：CVA10型30例，CVA6型46例，CVA5型10例，CVA2型6例，CVA3型2例，CVA4型2例，CVB2型2例，ECHO16型2例，另有7份PCR产物没有扩增，需进一步研究(表3)，部分条带电泳图，见图2。

3讨论

HFMD自1957年在新西兰首次报道后呈世界范围内流行,1958 年在加拿大分离并鉴定出CVA16为本病病原，1959 年将本病命名为“手足口病”，同时发现早期HFMD的主要病原以CVA16为主要病原。1974年Kennett等[3]对1969～1974年美国加利福尼亚地区20例脑膜炎或脑炎的患者进行病原学检测，首次从l例脑炎患儿(1969年)的粪便标本中分离出病毒并鉴定为EV71。1981年HFMD首次在我国上海报道，以后相继在北京、河北、天津、福建、吉林、上东、湖北和广东等十几个省(市)发现此病。而且自2008年安徽阜阳出现大范围暴发和流行以来，引起了社会的广泛关注。2008年5月，原国家卫生部将HFMD归为国家法定丙类传染病管理。

本研究运用RT-PCT对2013年贵阳地区的1 410例临床HFMD病例进行核酸检测，发现病原体主要为其他EV为主，其次为EV71和CVA16。其检测数据与贵阳地区2010年报道数据EV通用型阳性率为 68.27%，CVA16阳性率为6.73%，EV71 阳性率为13.46%[1]。2011年报道EV通用型核酸、EV71和CVA16核酸检出率分别为46.99%、5.80%、2.80%相比变化不大[4]。通过近年来对本地区EV病原监测，说明本地区的HFMD病原体主要是非EV71、非CVA16型其他型EV感染，对这些未分型EV进一步分型鉴定，将有助于全面了解本地区HFMD的病原谱，同时有助于分析是否存在非EV71、非CVA16的其他优势病毒型别，为HFMD防控工作提供明确的病原学依据。在目前常规的病原学核酸检测除用EV通用引物进行检测外，只进行EV71和CVA16的分型检测。李静等[5]报道南京2010年EV71阳性率为44.35%，CVA16阳性率为11.29%，其他EV阳性率为3.23%，胡海赘等[6]等报道上海2009～2011年检出EV71阳性率为31.8%，CVA16阳性率为30.5%，其他EV阳性率为10.0%。王彦霞等[7]报道河南省2008～2010年普通病例中EV71、CVA16和其他EV感染分别占51.06%、14.89%、34.05%。现已明确引起HFMD的EV有多种，以EV71和CVA16最为常见，但各地报道其病原构成也不一样，其病原构成具有明显的地域性。

HFMD病毒分离培养是HFMD病原诊断的金标准，但因为其分离鉴定繁琐、费力、耗时长，给快速检测和早期诊断工作带来困难，也无法满足疾病流行期间同时处理大量标本的需要，近年来PCR技术已成为诊断EV感染最常用的一种方法，目前主要用于检测EV通用、EV71和CVA16的分型。本研究通过VP4序列鉴定方法对1 410例临床HFMD病例非EV71、非CVA16型的其他型EV随机选出的107例进行PCR扩增及序列分析，结果为CVA6 46例、CVA10 30例、CVA5 10例、CVA2 6例，分别占其他EV的42.99%、28.04%、9.35%、5.61%；CVA3 2例、CVA4 2例、CVB2 2例、ECHO16 2例分别占其他EV的1.87%。有7例没有扩增成功，可能是病毒含量低，或者是病毒扩增区序列变异，没有进行设计VP1引物检测。在已检测的107株EV中，有46株为CVA6，有30株为CVA10，说明本地区非EV71、非CVA16型EV中的优势型别主要为CVA6，其次为CVA10。近年来CVA6与CVA10引起的报道较多，芬兰2008出现全国范围的HFMD大暴发，病原为CVA6和CVA10[8]，在新加坡，CVA10在HFMD病原中也占较高比例[9],2005年日本HFMD流行期间，CVA6和CVA10传播性比EV71强，但毒力比EV71弱[10],2009年，我国山东省也发现了由CVA10引起的HFMD暴发[11],且近年来报道CVA6和CVA10流行的文献陆续出现，提醒人们需加强对CVA6和CVA10的监测工作。

因此，在以后的HFMD病原学监测中应加强对EV的分型鉴定，以全面动态地了解其病原谱及优势病毒型别的变化，并进一步研究其生物学特性和分子流行病学特征，为HFMD的预测、预警和防治工作提供科技支撑。

参考文献

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[4] 杨兴林，熊金凤，李丽，等．贵阳地区 2010 年手足口病病原体检测分析[J].中国卫生检验杂志，2012，22(11)：2734-2736.

[5]李静，金玉，檀晓娟，等.2010年南京市手足口病患儿的病原构成及肠道病毒71型分子流行病学特征分析[J].中华儿科杂志，2012,50(4):267-270.

[6]胡海赘，乔蓉，沈琦，等.2009～2011年上海市手足口病病原学检测及其临床特点分析[J].中华实验和临床病毒学杂志，2012,26(5):341-343.

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Etiology study of hand,foot and mouth disease related non-EV71,non-CoxA16 enteroviruses in Guiyang area during 2013*

Yang Xinglin1,Liang Yuedong1,Hong Zhangping1,Xiong Jinfeng1,Wang Yunfen1,Huang Hai2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theFifthPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang,Guizhou550004,China;2.DepartmentofMedicalTest,GuiyangMedicalCollege,Guiyang,Guizhou550004,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the prevalence of non-EV71,non-CoxA16 enteroviruses strains of hand,foot and mouth disease(HFMD) in Guiyang,and analyze the genetic evolution of these non-EV71,non-CoxA16 enteroviruses strain,and to provide a basis for preventing and controlling (HFMD) in Guiyang.MethodsA total of 107 HFMD specimens tested positive for enteroviruses and negative for EV71 and CoxA16 were collected from April to June of 2013.The virus RNA was extracted,and the VP4 sequence was amplified by nested RT-PCR.The PCR positive products were sequenced and the enteroviruses type was identified by sequence BLAST.The sequence and phylogenetic analysis of the predominant virus type was performed.Results100 out of 107(93%)specimens were tested positive by nested RT-PCR,among which 100 PCR products were successfully sequenced.And the types of the 100 enterovirus strains were identifled by sequence BLAST：46 CoxA6,30 CoxA10,10 CoxA5,6 CoxA2,2 CoxA3 and 2 CoxA6,2 CoxB2 and 2 ECHO16.CoxA6 accounted for 42.99% in typed non-EV71,non-CoxA16 enterovimses,and was the predominant type.ConclusionHand,foot and mouth disease in Guiyang was conceded with diverse enteroviruses,and CoxA6 was the predominant type among non-EV71,non-CoxA16 enteroviruses.

[Key words]hand,foot and mouth disease;enterovirus;genotype

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.012

*基金项目：贵阳市科技局项目(筑科合[2013103]9号);贵阳市高层次创新型青年卫生人才项目(筑卫合[2013]创2号)。

作者简介：杨兴林(1976-)，主管检验技师，本科，主要从事分子生物研究。△通讯作者，Tel:18685021938;E-mail:ldy302@163.com。

[中图分类号]R512.5

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)17-2343-03

(收稿日期：2015-11-08修回日期：2016-02-26)