燕麦镰刀菌GD-2产除草活性物质的初步研究

程　亮

(青海省农林科学院植物保护研究所，青海省农业有害生物综合治理重点实验室，农业部西宁作物有害生物科学观测实验站，西宁　810016)

燕麦镰刀菌GD-2产除草活性物质的初步研究

程亮

(青海省农林科学院植物保护研究所，青海省农业有害生物综合治理重点实验室，农业部西宁作物有害生物科学观测实验站，西宁810016)

为明确燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum)中除草活性物质，以野燕麦种子为靶标，采用活性追踪法，对燕麦镰刀菌正丁醇萃取物进行活性成分分离和活性测定。正丁醇萃取液旋转蒸发去溶剂后进行硅胶柱层析，以二氯甲烷和甲醇的混合液进行梯度洗脱，每50 mL收集为一个馏分，共收集到50个馏分。生物测定结果表明：以二氯甲烷和甲醇的体积比为20∶1的混合液，洗脱得到的馏分24～27对供试杂草野燕麦表现出较强的活性，其对野燕麦的除草抑制作用均为4级。合并馏分24～27，以二氯甲烷和甲醇的体积比为15∶1的混合液作为展开剂进行薄层层析(TLC)，通过生物测定结果表明，Rf值在0.47～0.58的活性条带对野燕麦有较强的除草抑制活性，对野燕麦的除草抑制作用达到5级。HPLC分析发现，该活性条带主要含有3个组分，最大吸收峰在260 nm，其保留时间分别为6.378、19.721和22.403 min。

燕麦镰刀菌；除草活性；分离纯化

野燕麦(AvenafatuaL.)是麦类田间一种分布广泛的恶性杂草，与小麦形态相似，生长发育时期相近，难以防除，给作物生产带来严重威胁。目前，人们一般使用化学农药对野燕麦进行防除，但长期使用化学农药导致诸如抗药性增强、环境污染、生态破坏等一系列恶性问题[1]。因此，研究开发新型除草剂迫在眉睫。筛选和利用自然界微生物中具有生物活性的代谢产物，研究开发新型生物源除草剂，类同于化学合成除草剂，该类型除草剂因具有定向性、研制周期短、研发费用相对低廉等优势，所以更受到化学家们的重视。

目前，从土壤中分离的微生物所产活性化合物直接用作商品除草剂使用的是双丙氨膦(bilanafos)，广泛用于免耕地和果园防除1a生和多年生禾本科及阔叶杂草[2]。张蕴等[3]报道从马蜂肠道分离出的马蜂肠道真菌(Amaranthusretroflexus)对反枝苋具有很好除草活性。薛章荣等[4]研究发现浅灰链霉菌CGMCC1370对阔叶杂草和部分禾本科杂草有很好的防除效果。Oleskevich等[5]从自然患病的悬钩子属(Rubusspp.)植株上分离的燕麦镰刀菌产生的串珠镰刀菌素(moniliformin)毒素对属下不同的种有很好的除草效果。

镰刀菌属(Fusariumspp.)是一大类广泛分布在土壤和植物体内的丝状真菌，其中包含多种极具破坏性的植物致病真菌。镰孢菌能够产生单端孢霉烯、伏马毒素和玉米赤霉烯酮等真菌毒素(mycotoxin)和其他类型的次生代谢产物[6-7]。但镰刀菌毒素不但能影响真菌对植物的侵染，而且对人和动物具有毒害作用[8]，所以开发此类生物除草剂应当对人畜的安全性进行测试。

本研究采用生物活性跟踪分离方法，从燕麦镰刀菌正丁醇提取物分离纯化出活性成分，并对其抑制野燕麦种子萌发活性进行测试，旨在为开发高效、低毒、低残留与环境友好的新型除草剂奠定基础。

1材料与方法

1.1供试菌株

燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum) GD-2菌株，采自青海贵德罹病的野燕麦植株，菌株保存于青海省农业有害生物综合治理重点实验室。

1.2供试杂草

野燕麦(AvenafatuaL.)种子，采集青海省农科院试验田自然成熟的种子。

1.3培养基

PDA 培养基用于病菌的保存和菌饼的制备；PD 培养基用于GD-2菌株的液体发酵培养。

1.4试剂与仪器

正丁醇(分析纯)，天津市百世化工有限公司；甲醇(分析纯)，天津市北辰方正试剂厂；二氯甲烷(分析纯)，上海广诺化学科技有限公司；柱层析硅胶(300～400目)，山东烟台江友硅胶开发有限公司；硅胶制备板(20 mm×20 mm)，山东烟台江友硅胶开发有限公司。甲醇(色谱纯)，德国默克公司。

旋转蒸发仪N-1100，埃朗科技国际贸易(上海)有限公司；真空泵SHZ-DIII，郑州长城科工贸有限公司；高效液相色谱仪LC-10F，天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.5除草活性物质的分离纯化

将培养好的斜面种子接种于已消毒的发酵培养基中，在28 ℃下振荡培养144 h，得到发酵液30 L。将发酵液于5 000 r·min-1离心20 min，将沉淀部分用10 Lφ=80%丙酮浸泡过夜。冷冻离心去除沉淀，将上清液减压旋转浓缩去除丙酮，然后与发酵液合并。用等体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇相浓缩蒸干，再用甲醇浸取2遍，过滤除去甲醇不溶物，真空浓缩除去甲醇，获得粗品。

粗品经硅胶柱层析分离，以不同体积比的二氯甲烷和甲醇混合液作洗脱液，其体积比分别为20∶1(1 500 mL)、15∶1(800 mL)和3∶1(500 mL)的流动相进行洗脱，分部收集，根据生物活性跟踪结果，将活性部分浓缩，得到淡黄色固体。用少量甲醇溶解，进行薄层层析(TLC)分离制备，展开液配比为二氯甲烷∶甲醇=15∶1，记录除草活性物质条带Rf值，将具有除草活性最高的条带刮下，用无水甲醇浸泡过夜，过滤，滤液减压浓缩至10 mL 左右，再用制备型高效液相色谱(HPLC)进一步分离纯化(制备柱型号:COSMOSIL 5C18-MS-II，20 mm I.D. × 250 mm，日本半井公司，流动相为V(甲醇)∶V(水)=10∶90，流速16 mL ·min-1，检测波长260 nm)。整个分离纯化过程以除草活性为生物活性跟踪。

1.6生物活性测定

硅胶柱层析分离所得馏分生物活性测定采用种子萌发抑制法。首先用φ=1%次氯酸钠对野燕麦种子消毒3 min，然后用无菌水冲洗3次，室内晾干，备用。在d=6 cm 的培养皿中放入同皿底大小的双层滤纸，灭菌后备用。在每皿中加入1 mL毒素稀释液(为减少溶剂对种子萌发的影响，取粗毒素处理液0.5 mL均匀滴加到滤纸上，待滤纸完全干后再均匀滴加0.5 mL灭菌水)，在上述处理的培养皿中均匀摆放20粒杂草种子，置于光照12 h 、黑暗12 h ，25 ℃条件下培养，并以灭菌水作对照，每个处理重复4次，3 d后检测种子萌发情况。

种子萌发标准以种子发芽长度超过种子长度计，种子萌发抑制率按下列公式计算。

种子萌发抑制率=(对照组种子萌发率-处理组种子萌发率)/对照组种子萌发率×100%

芽(根)长抑制率=[对照组平均芽(根)长-处理组平均芽(根)比]/对照组平均芽(根)长×100%

除草抑制作用分级标准如表1所示。

表1　除草抑制作用分级标准

TLC层析板生物活性测定方法：利用层析板将合并馏分在薄层板上展开后，以层析板为载体，将12 g/L的水琼脂铺于板上，厚约0.5～1 cm，待琼脂凝固后，将野燕麦种子点种于琼脂平板上，然后将琼脂平板放在盛有少量水的塑料方盒中，并用小木棒将琼脂板架起来，以防浸水，最后用封口膜密封保湿，放置在26～28 ℃温箱中培养，96 h后检查野燕麦种子萌发结果。

2结果与分析

2.1硅胶柱层析及薄层层析

将除草活性物质粗提物进行硅胶柱层析，以二氯甲烷和甲醇(体积比为20∶1、15∶1和3∶1)的混合液对其进行梯度洗脱，每50 mL收集为一个馏分，共收集到50个馏分。将所收集到的馏分分别用甲醇稀释，利用种子萌发抑制法对野燕麦进行除草活性测定，结果表明柱层析后所得到的馏分都对野燕麦表现出不同程度的活性，其中馏分24～27对野燕麦的抑制作用达到4级，其余馏分活性较弱，如馏分31、馏分32对野燕麦的抑制作用为3级，馏分4、馏分5等对野燕麦的抑制作用为2级，馏分1、馏分2等对野燕麦的抑制作用为1级(表2)。

从图1可以看出，TLC薄层板上除草活性物质条带位置在Rf为0.47～0.58之间，对野燕麦种子萌发有很强的抑制作用，胚芽和胚根伸长被很好的抑制，TLC薄层板上Rf大于0.58的物质条带，除草活性次之，对野燕麦种子萌发有弱的抑制作用，Rf小于0.47的物质条带，除草活性最弱，对野燕麦种子萌发无抑制作用。

表2　柱层析所得馏分的除草活性

图1　馏分24～27合并生物测定结果

2.2 除草活性条带的HPLC分析

将制备TLC薄层板上得到的具有较强除草活性的条带转溶于甲醇中进行HPLC分析。图2为活性条带的HPLC分析图，可见该条带主要包含3个组分，其保留时间分别为6.378、19.721和22.403 min，分别标记为组分1、组分2和组分3，分别将3个组分进行收集制备，利用种子萌发抑制法测定其对野燕麦的活性(图3 为3个组分处理3 d的症状)，可见3个组分都表现不同程度的除草活性，其中组分2对野燕麦的根长抑制率达到91.37%，芽长抑制率为78.82%，组分1对野燕麦的芽长抑制率为81.18%，根长抑制率为85.49%，组分3对野燕麦的芽长抑制率为80.58%，根长抑制率为83.53%。

图2　活性条带的HPLC分析

图3　活性条带各组分对野燕麦的活性

3讨 论

近年来，研究杂草病原真菌代谢产物的毒素物质，以寻找新的天然除草剂化合物或为仿生合成新型除草剂提供依据，已成为农田杂草生物防治研究的热点之一。迄今为止，已报道有近20 属真菌的 100 余种代谢产物具有较强的除草活性并具有开发为除草剂的潜力，研究报道最多的产生除草活性毒素的植物病原真菌，主要来自链格孢菌属(Alternaria)、镰刀菌属(Fusarium)、刺盘孢菌属(Colletotrichum)等。如Chen 等[9]从紫茎泽兰叶斑病菌(Alternariaalternata)分离到AAC毒素，可显著抑制紫茎泽兰的光合电子传递；高松梅等[10]从瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum) PAC菌株的代谢产物分离到对马唐有较强抑制作用的除草活性组分；Jiang等[11]从画眉草弯孢霉(Curvulariaeragrostidis) QZ-2000菌株的代谢产物分离到对马唐种子的幼根幼芽生长表现出明显抑制作用的化合物α,β-dehydrocurvularin；郑蒙等[12]从灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers.)诱变菌株BC7-3的代谢产物中分离到对马唐具有很强除草活性的化合物10-顺-二氢化灰霉二醛(10-syn-dihydrobotrydial)。Vikrant等[13]从茎点霉(Phomaherbarum)的代谢产物中分离到对银胶菊具有很强活性的3-硝基邻苯二甲酸。

已往研究曾采用薄层层析分离天然除草活性物质[14-15]，但该方法上样量小，分离组分用于生测后难以有足够的量进行第2 次分离。本试验选用硅胶作固定相，二氯甲烷和甲醇混合溶剂作洗脱剂，对除草活性物质进行柱层析，取得较好的分离效果，说明此方法对燕麦镰刀菌除草活性物质进行粗分是可行的。采用活性跟踪方法，对获得的馏分进行逐步分离纯化。首先采用水琼脂平板法，确定薄层板上的除草活性条带区域的Rf值范围，刮板后达到进一步去除非除草活性物质的目的。后期HPLC分析制备获得的除草活性组分的量比较少，生物活性测定采用容器直径较小的瓶盖。HPLC 分析结果显示虽然得到3个组分，但从分析结果图上看，组分2 和3 两个保留时间的峰很接近，即组分2为19.721 min，组分3为22.403 min，这2个组分尚未完全分开，这2个峰可能是难分离物质对或者可能由多个异构体组成，如果将其收集起来并进一步进行HPLC分离，可能会得到更好的分离效果。

本研究仅分离高活性馏分段的除草活性化合物，其他馏分段也具有一定的除草活性，因此，有必要对这些馏分段继续分离。此外，本研究仅仅对正丁醇提取的活性物质进行分离，尚未对其他有机溶剂(乙酸乙酯、石油醚等)萃取物中的活性物质进行分离，有必要对其进一步研究。

本研究从燕麦镰刀菌GD-2代谢产物中获得3个组分，这几个组分对野燕麦种子萌芽均具有很好的抑制活性，是GD-2具有除草活性物质的基础。因此，GD-2具有开发为微生物除草剂的潜力，值得深入研究。

Reference：

[1]吴明荣,唐伟,陈杰.我国小麦田除草剂应用及杂草抗药性现状[J].农药,2013,52(6):457-460.

WU M R,TANG W,CHEN J.Herbicide application and resistance in wheat field of China [J].Pesticides,2013,52(6):457-460(in Chinese with English abstract).

[2]COPPING L G,DUKE S O.Natural products that have been used commercially as crop protection agents [J].PestManagementScience,2007,63 (6):524-554.

[3]张蕴,邵明伟,张应烙,等.马蜂肠道菌抑制反枝苋的活性筛选及菌株MF06的活性代谢产物[J].微生物学报,2015,55(3) :292-298.

ZHANG Y，SHAO M W，ZHANG Y L,etal.Inhibition ofAmaranthusretroflexusby wasp gut fungal isolateFusariumoxysporumMF06[J].ActaMicrobiologicaSinica,2015,55(3):292-298(in Chinese with English abstract).

[4]薛章荣,徐文平,陈杰,等.浅灰链霉菌CGMCC1370及其代谢产物除草活性研究[J].农药学学报,2011,13 (2):155-161.

XUE ZH R,XU W P,CHEN J,etal.Study ofStreptomycesgriseolusCGMCC1370 and its herbicidal metabolite [J].ChineseJournalofPesticideScience,2011,13 (2):155-161(in Chinese with English abstract).

[5]OLESKEVICH C,SHAMOUN S F,VESONDER R F,etal.Evaluation ofFusariumavenaceumand other fungi for potential as biological control agents of invasiveRubusspeciesin British Columbia [J].CanadianJournalofPlantPathology,1998,20(1):12-18.

[6]KRISTENSEN R,TORP M,KOSIAK B,etal.Phylogeny and toxigenic potential is correlated inFusariumspecies asrevealed by partial translation elongation factor 1 alpha gene sequences [J].MycologicalResearch,2005,109(2):173-186.

[7]DESJARDINS A E,Proctor R H.Molecular biology ofFusariummycotoxins[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2007,119(1/2):47-50.

[8]ALEXANDER N J,PROCTOR R H,MCCORMICK S P.Genes,gene clusters,and biosynthesis of trichothecenes and fumonisins inFusarium[J].ToxinReview,2009,28(2/3):198-215.

[9]CHEN S G,DAI X,QIANG S,etal.Effect of a nonhost-selective toxin fromAlternariaalternataon chloroplast-electron transfer activity inEupatoriumadenophorum[J].PlantPathology,2005,54(5):671-677.

[10]高松梅,张利辉,张中东,等.瓜果腐霉菌丝中除草活性物质的初步研究[J].微生物学通报,2011,38(9):1400-1404.

GAO S M,ZHANG L H,ZHANG ZH D,etal.Primary study of herbicidal substance in mycelia ofPythiumaphanidermatum[J].MicrobiologyChina,2011,38(9):1400-1404(in Chinese with English abstract).

[11]JIANG S J,QIANG S,ZHU Y ZH,etal.Isolation and phytotoxicity of a metabolite fromCurvulariaeragrostidisand characterization of its modes of action[J].AnnalsofAppliedBiology,2008,152(1):103-111.

[12]郑蒙,徐扩,董金皋.灰葡萄孢BC7-3菌株除草活性组分的纯化与结构鉴定[J].微生物学报,2008,48(10):1362-1366.

ZHENG M,XU K,DONG J G.Purification and structural identification of herbicides fromBotrytiscinerea[J].ActaMicrobiologicaSinica,2008,48(10):1362-1366(in Chinese with English abstract).

[13]VIKRANT P,VERMA K K,RAJAK R C,etal.Characterization of a phytotoxin fromPhomaherbarumfor management ofPartheniumhysterophorusL.[J].JournalofPhytopathology,2006,154(7/8):461-468.

[14]李铭刚,Groth Ingrid,李一青,等.薄层层析指导下的嗜碱放线菌菌株YIMGQ-14次生代谢产物研究[J].微生物学报,2003,43(4):481-486.

LI M G,GROTH I,LI Y Q,etal.The secondary metabolites research of theAlkalophlicstrain YIMGQ14 tracked by the TLC assay [J].ActaMicrobiologicaSinica,2003,43(4):481-486(in Chinese with English abstract).

[15]叶建仁,杨斌,包宏,等.松针褐斑病菌毒素的层析分离及紫外吸收特性研究[J].南京林业大学学报(自然科学版),2004,28(2):7-11.

YE J R,YANG B,BAO H,etal.A study on separation of toxins producing byLecanostictaacicolacausing brown spot needle blight of pines [J].JournalofNanjingForestryUniversity(NaturalSciencesEdition),2004,28(2):7-11(in Chinese with English abstract).

The authorCHENG Liang, male, doctoral student. Research area:biological control of weed with pathogens. E-mail:liangcheng1979@163.com

(责任编辑：史亚歌Responsible editor:SHI Yage)

Primary Study of Herbicidal Active Metabolites fromFusariumavenaceumGD-2

CHENG Liang

(Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management in Qinghai Province,Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pest in Xining of Ministry of Agriculture, Institute of Plant Protection,Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Science,Xining810016,China)

In order to study herbicidal substances ofFusariumavenaceumagainst wild oat,AvenafatuaL.seeds was used to screen herbicidal components from n-butanol extracts by bioassay. The n-butanol extracts were separated gradually by silica gel column using dichloromethane and methanol mixtures (V∶V=20∶1) as the developers. Eluents were collected in each 50 mL and 50 fractions were used for bioassay. The results revealed that fraction 24-27 showed strong activity againstAvenafatuaL. with the inhibition level of 4.The combined fractions of 24-27 were eluted with the mixture of dichloromethane and methanol (V∶V=15∶1) as the developer and active bands were collected. Bioassay results showed that the bands withRf0.47-0.58 had the stronger inhibitory activity againstAvenafatuaL. and the inhibition to weed reached four degree. HPLC analysis suggested that this fraction mainly contained 3 components and had the maximum absorption peak at 260 nm,the retention time of which was 6.378, 19.721 and 22.403 min respectively.

FusariumavenaceumGD-2；Herbicidal activity；Isolation and purification

2015-04-17

2015-07-21

National Natural Science Foundation of China (No. 30860165, 31160371); the “12th Five-year-Plan” National Science and Technology Support Program (No.2012BAD19B02); Youth Scientific Research Foundation of Qinghai University(No.2015-QNY-2)；Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest of Ministry of Agriculture(No.201303022).

1004-1389(2016)07-1074-06

2015-04-17修回日期：2015-07-21

国家自然科学基金(30860165，31160371)；“十二五”国家科技支撑计划(2012BAD19B02)；青海大学中青年科研基金(2015-QNY-2)；农业部公益性行业(农业)科研专项(201303022)。

程亮，男，博士研究生，研究方向为杂草生物防治。E-mail:liangcheng1979@163.com

S482.4

A

网络出版日期：2016-06-30

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160630.1634.036.html