基质固相分散-高效液相色法测定电子烟烟油中的苯并[α]芘

徐兴梦，叶 灵，张凤梅，刘春波，申钦鹏，何 沛，司晓喜，朱瑞芝，王昆缪，刘志华，缪明明*

(1.云南省烟草化学重点实验室/云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650231;2.昆明医科大学 药学院/云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500)



基质固相分散-高效液相色法测定电子烟烟油中的苯并[α]芘

徐兴梦1,2，叶 灵1，张凤梅1，刘春波1，申钦鹏1，何 沛1，司晓喜1，朱瑞芝1，王昆缪1，刘志华1，缪明明1*

(1.云南省烟草化学重点实验室/云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650231;2.昆明医科大学 药学院/云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500)

摘要：采用基质固相分散-高效液相色法测定电子烟烟油中的苯并[α]芘(B[α]P)，电子烟烟油样品用硅胶分散，然后用带柱层析净化功能的索氏提取器净化，经提取净化后的样品用超高效液相色谱-荧光检测测定，该方法中B[α]P的检出限为3.5 ng/mL，定量限为10.0 ng/mL，样品B[α]P加标回收率在91.2%～95.7%之间。采用该方法的样品前处理可避免常规样品前处理过程中的多次转移、浓缩，简化了操作步骤，缩短了前处理时间，有效减少分析误差，且有机溶剂用量大大减少，减少了对环境的污染。该方法用于电子烟烟油样品的测定，结果令人满意。

关键词：基质固相分散；高效液相色谱法；电子烟烟油；苯并[α]芘

苯并[α]芘(B[α]P)是第1个被发现的多环芳烃类环境致癌物，也是众多的多环芳烃中致癌活性最强的化合物；肿瘤流行病学调查及动物实验研究发现B[α]P具有较强致癌性，尤其与人类肺癌的发生高度相关[1]。目前B[α]P的测定已列为烟草安全评价的重要检测指标。电子烟作为一种新型烟草制品，是通过直接雾化电子烟油来产生烟气；由于避免了复杂的烟丝燃烧，其有害成分释放量比常规卷烟大大减少[2]。但是电子烟烟油成分复杂，含甘油、丙二醇、烟草提取物、食用香料等多种人工合成或天然植物提取成分，在烟油制备过程中原料和使用的溶剂都有可能会受到污染而含B[α]P。因此电子烟油中苯并[α]芘的测定对保障电子烟的安全性具有一定意义，目前电子烟油中苯并[α]芘的测定还未见文献报道过。

目前B[α]P测定已得到实际应用的方法是GC-MS法[2-6]和HPLC-FLD法[7-11]。由于样品基体成分复杂，B[α]P的含量又属于痕量分析，样品基质中又存在大量的干扰物质，因此B[α]P的测定都需要通过复杂的样品处理，前处理方法主要有溶剂提取、固相萃取或凝胶色谱(GPC)净化等方法。这些方法样品前处理需多次的浓缩、转移，操作非常麻烦，可引入实验误差的因素多；而且耗费大量有机溶剂，对环境污染大。我们研究了用基质固相分散-高效液相色法测定电子烟油中的B[α]P。电子烟油用硅胶分散，然后用带柱层析净化功能的索氏提取器净化。经提取净化后的样品用超高效液相色谱-荧光检测测定。与常规B[α]P测定的方法相比，该方法简化了样品前处理操作步骤，提高了分析结果的精密度；此外，新装置还能显著减少前处理过程中有机溶剂用量，大大降低了样品前处理过程中有机溶剂向环境中的散发，从而减少了样品处理过程中的环境污染。方法实际应用于电子烟烟油中B[α]P的测定，取得了满意的结果。

1实验部分

1.1材料、试剂与仪器

电子烟烟油均购于淘宝网。

B[α]P标准品(纯度>98%,Αldrich,USA)；环己烷、乙醇和乙腈(色谱纯，DIKMA Pure，USA)；无水硫酸钠(分析纯，由天津化学试剂厂生产)；200～300目硅胶(分析纯，由青岛海洋化工厂生产)。

分析天平(感量0.0001 g，瑞士Mettler Toledo公司)；ACQUITY超高效液相色谱仪(配荧光检测器)，美国Waters公司，Empower色谱工作站；KQ-500 DB超声波清洗器(广州沪瑞明仪器有限公司)。

1.2带柱层析功能的索氏提取装置

带柱层析功能的索氏提取装置结构见图1，该装置由回流冷凝管(1)、提取器(3)和圆底烧瓶(8)3部分组成，烧瓶的底部设有一段1～2 mL的尾管(7)，提取器是由溶剂气流管(4)和填料管(15)上部相连而成的“U”形管，溶剂气流管下端接烧瓶磨口(5)，填料管中装有筛板(11)。填料管上端接回流冷凝管(1)，下端的管件通过三通阀(10)后接于烧瓶，三通阀的另一出口接溶剂回收口(9)，回流冷凝管的液滴出口垂直正对填料管上方。

提取器为异径的“U”形管，溶剂气流管的管径为10～15 mm，填料管的管径为35～40 mm，提取器与回流冷凝管相接的磨口(2)至填料管底部的距离为160～200 mm。

筛板上放置柱层析材料硅胶层(12)，样品(13)置于硅胶层上面，再在上面加一层无水硫酸钠(14)用于样品干燥。烧瓶中加入溶剂(6)，加热回流时蒸发上来的溶剂通过三通阀回到圆底烧瓶形成回流；样品提取完后转动三通阀至溶剂回收口，溶剂则可从回收出口流出，实现样品浓缩。

图1　新样品前处理装置的结构图

1.3测定方法

1.3.1标准溶液的配制B[α]P标准溶液的配制：精密称取10.0 mg苯并[α]芘，用环己烷溶解后移入100 mL棕色容量瓶中，并稀释至刻度，得到含苯并[α]芘0.01 mg/mL的储备液；使用时用环己烷稀释成所需浓度的标准工作液。

1.3.2色谱条件色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm×2.1 mm×50 mm)，柱温40 ℃；流动相为乙腈/水(68/32)，流速0.5 mL/min；荧光检测器(FID)的激发波长384 nm；发射波长406 nm；在该色谱条件下苯并[α]芘标样和电子烟油的液相色谱图见图2。

图2　标样(b)和烟油样品(α)的色谱图

1.3.3样品处理准确称取电子烟油样品5.0 g，然后在样品中加入10.0 g的硅胶和烟油样品充分研磨均匀。在图1所示的索氏提取装置中加入10 g硅胶层，然后把上述附着了烟油样品的硅胶加到索氏提取器中，再在上面铺2.5 g无水硫酸钠。装好样品后，在烧瓶中加入80 mL己烷-乙醇(98∶2)的混合溶剂，然后将上述样品前处理装置放入水浴锅中，在90 ℃下加热回流45 min提取样品。样品提取完后，打开三通阀(10)，让溶剂从溶剂回收口流出回收溶剂，直至烧瓶尾管中的样品溶液蒸发到近干。用1 mL的乙腈溶解尾管中的残留物，溶液经针头过滤器过滤，按选定色谱条件测定苯并[α]芘含量。

2结果与分析

2.1方法原理

对苯并[α]芘的测定，样品前处理分为样品提取、固相萃取(或柱层析)净化、浓缩三步[12]；一般采用的方法为样品用环己烷提取，然后用硅胶固相萃取柱(或反相固相萃取)净化，然后再供仪器分析用。而采用本文中的索氏提取装置，启动水浴锅加热，溶剂蒸发后再经回流冷凝管(1)冷凝回到提取器中；经无水硫酸钠层(14)干燥，然后再把样品中的苯并[α]芘洗脱下来；经过下面的硅胶柱(12)净化，这样杂质保留在硅胶柱上，而苯并[α]芘则被溶剂洗脱而进入圆底烧瓶中，经过一段时间的回流提取，样品中的苯并[α]芘被完全提取；然后转换三通阀，让溶剂从溶剂回收出口流出，这样圆底烧瓶中的溶液不断被浓缩，当浓溶剂快蒸发完后，用乙腈溶解尾管中的残留物，即可供液相色谱分析用。

2.2萃取、净化溶剂的选择

苯并[α]芘测定样品前处理的关键步骤是硅胶固相萃取净化，溶剂的选择非常重要，溶剂对硅胶柱的洗脱强度适当才能将苯并[α]芘从硅胶柱上洗脱，并让杂质更多地保留在柱上，从而达到样品净化的目的。传统方法一般用一种洗脱强度小的溶剂(环己烷)和一种洗脱强度大的溶剂(乙醇或异丙醇)混合作为洗脱剂，通过调配两者的比例调节洗脱强度。在本方法中，要求2种溶剂的沸点相近，以保持在水浴加热时能达到基本同时气化。环己烷的沸点(80.6 ℃)和乙醇的沸点(78.4 ℃)非常接近，而且传统的柱层析分离中也经常使用这2种溶剂混合调节溶剂强度作为正相色谱的流动相，因此本实验中选择环己烷和乙醇混合作为本实验中的提取、净化溶剂。结果表明：环己烷和乙醇的比例为98∶2时具有最好的样品提取、净化效果，不但能让待测成分完全被洗脱，而且还能让电子烟油中的其他杂质吸附在硅胶上达到样品净化的效果。因此，本实验中选择环己烷-乙醇(98∶2)作为前处理中的溶剂。

2.3萃取剂体积的选择

在本实验中，需在提取装置中加入足够量的溶剂，以保持溶剂在整个前处理过程中能循环；本实验中采用体积为50 mL的提取管，实验表明，当提取装置中的溶剂量达60 mL时能保持正常循环，但考虑到在样品前处理过程中溶剂因蒸发而有少量损失，因此选择在提取器中加入80 mL的环己烷-乙醇混合溶剂。

2.4水浴温度的选择

在本实验中，环己烷的沸点为80.6 ℃，乙醇的沸点为78.4 ℃，当水浴温度超过85 ℃时，尾管烧瓶中的溶剂开始沸腾，随着温度增加，溶剂蒸发速度迅速加快，当温度达到90 ℃时溶剂蒸发速度能达到5 mL/min左右(稍大于硅胶柱上的流下速度)，温度过低则蒸发慢，需延长样品处理时间，温度过高则会增加提取过程中的溶剂损失，因此，实验选择水浴温度为90 ℃。

2.5萃取时间的选择

选取经硅胶分散、烘干后的电子烟油样品，在90 ℃的水浴中进行回流提取，考察提取时间对苯并[α]芘测定结果的影响。比较了提取时间分别为20、25、30、35、40、45、50、60 min的测定结果，结果表明：萃取时间在40 min以后萃取效率达到一个稳定值，苯并[α]芘的测定结果趋于稳定，进一步延长提取时间则会导致更多的杂质被洗脱而影响样品的净化效果；为节约时间并避免引入更多的干扰成分，因此，选择回流45 min作为样品提取的最佳时间。

2.6色谱条件的选择

在选定色谱柱的情况下，笔者对流动相进行了选择,由于本方法采用荧光检测器检测，用甲醇作为流动相背景值高，因此采用乙腈-水作为流动相。并且实验设置了不同比例的乙腈和水作为流动相(包括梯度)，结果表明：用梯度洗脱基线不平，会向上漂移；用等度洗脱基线相对平稳，用68%的乙腈-水溶液为流动相，待测成分能达到基线分离且时间短，因此本实验选用68%的乙腈-水作为流动相。

通过荧光检测器扫描可得苯并[α]芘的激发光谱和发射光谱图，苯并[α]芘最大激发波长为384 nm，最大发射波长为406 nm，因此本实验中选择该激发波长和发射波长。

2.7工作曲线、检出限和检测限

准确称取一定量的苯并[α]芘标准样品，配制一系列标准溶液(10.0、20.0、40.0、80.0、120.0、200.0 ng/mL)进行HPLC分析，以标样峰面积(A)和浓度(C)进行线性回归，得到线性回归方程。苯并[α]芘的回归方程为：A=2682C+14.56，线性范围为10～200 ng/mL，r=0.9996；根据信噪比(S/N=3)得苯并[α]芘的检出限为3.5 ng/mL，根据信噪比(S/N=10)得到苯并[α]芘的定量限为10.0 ng/mL。

2.8精密度实验

电子烟油样品按本实验前处理方法处理后，在相同条件下平行测定7次(同批次处理)，并计算7次平行测定结果的相对标准偏差，可得苯并[α]芘的RSD为3.5%，说明本方法精密度良好。同上，样品处理完后在不同时间内测定(每天测定1次，共7次)，计算7次测定结果的相对标准偏差，可得苯并[α]芘的RSD为4.0%，说明在不同时间内测定，本方法精密度仍然良好。

2.9回收率与检测限实验

电子烟油样品测定时每样准备相同样品4份，其中1份为参比，另3份分别加入已知量的标品(苯并[α]芘)，设10、30、50 ng共3个添加量。样品按选定的样品前处理条件进行处理，并按选定色谱条件进样分析，通过加入标准的测出量除以标准加入量计算回收率；得到苯并[α]芘的回收率，在91.9%～93.6%之间，说明本方法回收率较好。

2.10样品分析结果

采用本方法对电子烟烟油中的苯并[α]芘进行测定，并用文献[12]报道的环己烷萃取净化法进行对照。由表1可知，采用本方法的测定结果与文献报道方法的分析结果具有较好的一致性，说明本方法准确可靠。

表1　电子烟烟油中苯并[α]芘的测定结果

注：/表示低于定量限。

3结论

本文研究了用基质固相分散-高效液相色法测定电子烟烟油中的苯并[α]芘。本方法采用硅胶基质固相分散处理，然后用带柱层析净化功能的索氏提取器净化。采用该装置可将常规方法中的提取、柱层析净化、浓缩三步在线连接起来，避免了样品前处理过程中的转移、浓缩，简化了操作步骤，还可有效地减少分析误差，使测定结果更加准确，而且样品处理在相对封闭的装置中完成，避免了常规前处理方法中许多敞开操作，减少了有机溶剂向环境中的散发，降低了环境污染。本方法还采用超高效液相色谱技术，12 min完成一个样品分析，与常规液相色谱法相比，分离时间大大缩短，提高了工作效率。实际样品分析结果表明，本方法的回收率高，重复性好，且测定结果与对照方法检验结果相符合。

参考文献：

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[12] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB/T 21130─2007卷烟 烟气总粒相物中苯并[α]芘的测定[S].

(责任编辑：曾小军)

Study on Determination of Benzo [α] Pyrene in Electronic Cigarette Liquids by Using Matrix Solid-phase Dispersion and High Performance Liquid Chromatography

XU Xing-meng1,2, YE Ling1, ZHANG Feng-mei1, LIU Chun-bo1, SHEN Qin-peng1, HE Pei1,SI Xiao-xi1, ZHU Rui-zhi1, WANG Kun-miao1, LIU Zhi-hua1, MIAO Ming-ming1*

(1. Key Laboratory of Tobacco Chemistry of Yunnan Province/ Research and Development Center, China Tobacco Yunnan Industrial Limited Company, Kunming 650231, China; 2. College of Pharmaceutical Science, Kunming Medical University/ Yunnan Provincial Key Laboratory of Pharmacology for Natural Drugs, Kunming 650500, China)

Abstract：A matrix solid-phase dispersion and RP-HPLC method for the determination of benzo [α] pyrene (B[α]P) in electronic cigarette liquids was studied, the electronic cigarette liquids samples were dispersed with silica gel, then the samples were purified by silica gel column chromatography combined with cable extraction, the purified samples were analyzed by high performance liquid chromatography equipped with fluorescence detector, the detection limit and quantitative limit for B[α]P reaches 3.5 ng/mL and 10.2 ng/mL, respectively, the developed method provide spiked recoveries of 91.2%～95.7% for B[α]P. In addition, compared to the tradition sample preparation method, the operation steps was greatly simplified, the environmental pollution was also reduced with lessen organic solvents used in this method, this method was applied to the determination of B[α]P in electronic cigarette liquids with good results.

Key words：Matrix solid-phase dispersion; High performance liquid chromatography; Electronic cigarette liquids; Benzo [α] pyrene

收稿日期：2015-11-18

基金项目：国家自然科学基金(21365026)。

作者简介：徐兴梦(1992─)，女，云南丽江人，硕士研究生，从事药物分析研究。*通讯作者：缪明明。

中图分类号：O657.63

文献标志码：A

文章编号：1001-8581(2016)06-0092-04