线粒体超离子与血管紧张素Ⅱ介导肾间质细胞外基质纤维化的研究

王均玲, 余 晨

(同济大学附属同济医院肾脏科，上海 200065)



·基础研究·

线粒体超离子与血管紧张素Ⅱ介导肾间质细胞外基质纤维化的研究

王均玲, 余 晨

(同济大学附属同济医院肾脏科，上海 200065)

肾脏纤维化； 血管紧张素Ⅱ； 活性氧； 超氧离子； NADPH氧化酶抑制剂； 大鼠

肾脏纤维化指在各种致病因素作用下，间质细胞及细胞间质增多，基质蛋白合成增加而降解减少造成细胞外基质(extracellular matrix, ECM)大量堆积导致的肾小球硬化和肾小管间质纤维化[1]。肾脏纤维化的机制目前还不是很清楚，血管紧张素-Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)是体内重要的血管活性物质之一，它参与调节细胞的增殖、凋亡以及纤维化进程[2]。以往对于AngⅡ-慢性肾脏疾病的氧化应激研究中，缺乏针对线粒体氧化应激的研究，尤其是AngⅡ 介导的线粒体氧化应激对肾脏纤维化的机制，本研究在大鼠肾脏成纤维细胞中探讨氧化应激与肾脏纤维化之间的相关机制，并验证超氧离子是否介导AngⅡ引起肾脏间质细胞外基质的合成。

1 材料与方法

NRK-49F细胞，由复旦大学生理与病理教研室赠送。

1.1 主要试剂和仪器

细胞培养液MEM (GIBCO)、FBS(GIBCO)、Apocycin(sigma2501950)，线粒体荧光探针Mito (invitrogen 1252221)， RNA抽提试剂盒(Invitrogen)，RT试剂ReverTra Ace®qPCR RT Kit(TOYOBO)，Realtime PCR反应试剂(TaKaRa)，Col1 抗体(Abcom34710)，Col3抗体(Abcom6310)，Fibronectin 抗体(F3648)二抗(抗IgG-Cy3 Jackson)，PCR引物由上海生工合成，RT试剂ReverTra Ace®qPCR RT Kit(TOYOBO)，Realtime PCR反应试剂(TaKaRa)，酶标仪，BioTek细胞流式仪(accun C6)，显微镜(Nikon)。

1.2 NRK-49F细胞线粒体超氧离子流式检测

将细胞分别传代于5个细胞瓶中，24h后进行分组： 空白组，AngⅡ组(AngⅡ溶度10-6)，apocynin组(apocynin溶度10-6),AngⅡ+apocynin组(溶度叠加)，每组设平行3组，药物干预24h后抽去含有药物的培养液，用可与线粒体特异性的超氧化物反应的荧光试剂Mito invitrogen 1252221 5μm 的工作溶度覆盖细胞，37℃，10min,消化液消化细胞，血清终止消化并收集细胞，1500转/min，离心半径10cm，离心5min，用0.01mol PBS悬浮细胞，上流式仪检测并设阴性对照组。

1.3 Mito荧光酶标检测NRK-49F细胞内线粒体含量

将细胞消化，离心后以每孔5.3×103的细胞数种植于96孔中，24h后进行分组： 空白组，AngⅡ组(AngⅡ溶度10-6)，apocynin组(apocynin溶度10-6),AngⅡ+apocynin组(溶度叠加)，每组设4复孔，药物干预24h后抽去含有药物的培养液用Mito (invitrogen 1252221)为5μm的工作溶度每孔加入50μl，37℃孵育10min，上酶标仪550波长检测并读取数据。

平均D值(平均吸光度)的计算：

复孔平均D值-空白平均D值 = 每组平均D值

1.4 Mito荧光显示NRK-49F细胞内线粒体分布

细胞消化，离心后将细胞种植于24孔培养板中，24h后进行分组，药物干预24h后抽去含有药物的培养液，用Mito 5μm的工作溶度覆盖细胞，37℃ 孵育10min，荧光显微镜(激发光： 590nm)下观察每组细胞内线粒体分布。

1.5 RT-PCR法检测

采用Trizol一步法抽提细胞RNA, 进行电泳与紫外分析检测，反转录反应严格依照试剂盒说明进行。引物设计如下： RatGAPDH。正向5,AGTGCCAGCCTCGTCTCATAG,下游CGTTGAA-CTTGCCGTGGGTAG；rCollagenⅠAAGGGTCATC-GTGGCTTCTCT，GACCGTTGAGTCCATCTTTGC；rCollagenⅢTCCCAGAACATTACATACCACTGC，TCTCATGGCCTTGCGTGTT；rFN GCTATGGAGG-AAGCAGAGGTTT，ACCAATCTTGTAGGACTGA-CCCC。扩增条件： 94℃变性(30s),56℃退火(30s),72℃延伸(30次循环，继续72℃延伸5min)，使用BIO-RAD(CFX-96)实时定量PCR仪器进行扩增，扩增完成后收集荧光定量数据进行分析，数据包括扩增曲线、工作曲线、融解曲线与相应Ct值等。

1.6 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NRK-49F细胞

图1 各组超氧离子吸光度比较图Fig.1 Comparison of superoxides absorbance by enzyme-labelling in different groups注： AngⅡ组与对照组相比，细胞荧光增强；AngⅡ+APO较AngⅡ组组荧光强度降低(P<0.05)

2.2 NRK-49F细胞

图2 流式细胞检测荧光阳性细胞结果比较图Fig.2 Comparison of fluorescence positive cells detected by flow cytometry in different groups注： AngⅡ组与对照组相比，阳性细胞数显著增多，AngⅡ+APO较AngⅡ组阳性细胞数显著降低(P<0.05)

2.3 NRK-49F细胞

培养24h，药物干预24h后，Real-time PCR检测Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN表达： Ang Ⅱ刺激组较对照组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN mRNA表达显著增加；Ang Ⅱ+APO组较Ang Ⅱ组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN mRNA表达有显著降低(两者均P<0.05，图3a，图3b,图3c)。

4NRK-49F细胞培养24h后，药物干预24h后，免疫荧光法检测Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN表达： Ang Ⅱ刺激组较对照组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表达显著增加，Ang Ⅱ+APO组较Ang Ⅱ组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表达有显著降低，两者均(P<0.05，图4a,4b,4c)。

图3a 荧光定量PCR结果各组中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、FN基因的mRNA相对表达量P<0.05Fig.3a The relative expression of Collagen-ⅠmRNA in different groups注： AngⅡ组与对照组相比，Collagen-ⅠmRNA表达有显著增多，AngⅡ+APO较AngⅡ组mRNA表达显著降低(P<0.05)

图3b Col-ⅢmRNA相对表达量Fig.3b The relative expression of Collagen-Ⅲ mRNA in different groups注： Ang Ⅱ 组与对照组相比，Collagen-Ⅲ mRNA表达有显著增多，Ang Ⅱ+APO较Ang Ⅱ 组mRNA表达显著降低(P<0.05)

图4a 免疫荧光检测Collagen-Ⅰ蛋白Fig.4a Immunofluorescence staining of Collagen-Ⅰ protein注： Ang Ⅱ刺激组较对照组，Collagen-Ⅰ表达显著增加，Ang Ⅱ+APO组较Ang Ⅱ组Collagen-Ⅰ蛋白表达有显著降低(P<0.05)

图4c 免疫荧光检测FN蛋白Fig.4c Immunofluorescence staining of FN protein注： AngⅡ刺激组较对照组FN表达显著增加，Ang Ⅱ+APO组较Ang Ⅱ组FN蛋白表达有显著降低(P<0.05)

5NRK-49F细胞培养24h，药物干预24h后，western blot 检测Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN蛋白表达。Ang Ⅱ刺激组较对照组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表达显著增加；Ang Ⅱ+APO组较Ang Ⅱ组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表达有显著降低(两者均P<0.05，图5)。

2.4 流式细胞检测线粒体超氧离子结果

Ang Ⅱ刺激组较对照组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表达显著增加；Ang Ⅱ+APO组较Ang Ⅱ组Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表达有显著降低(两者均P<0.05，图5)。

图5 各组的WB蛋白水平图Fig.5 The collagen Ⅰ, Ⅲ and fibronectin levels in different groups

3 讨 论

[1] Hui YL. Diverse roles of TGF-β/smads in renal fibrosis and inflammation[J]. Int J Biol Sci, 2011,7(7)： 1056-1067.

[2] 余莹，李长明，周沛然,等.坎地沙坦在炎症过程中抑制氧化应激反应机制的研究[J].同济大学学报： 医学版，2010，31(3)： 59-63.

[3] Doug YL, Fabien W, Assaad A,et al.Nox4 Nadph oxidase mediates peroxynitrite-dependent uncoupling of endothelial Nitric-oxide synthase and fibronectin expression in response to angiotensin Ⅱ： ROLE of mitochondrial reactive oxygen species[J].J Biol Chem, 2013，288(40)： 28668-28686.

[4] Sovari AA, Morita N. Karagueuzian HS, Apocynin： a potent NADPH oxidase inhibitor for the management of atrial fibrillation[J]. Redox Rep, 2008,13(6)： 242-245.

[5] Garrido AM. NADPH oxidases and angiotensin Ⅱ receptor signaling[J].Mol Cell Endocrinol, 2009,302(2)： 148-158.

[6] Piacenza L, Irigoín F, Alvarez MN, et al. Mitochondrial superoxide radicals mediate programmed cell death in Trypanosoma cruzi： cytoprotective action of mitochondrial iron superoxide dismutase overexpression[J]. Biochem J, 2007,403(2)： 323-334.

Mitochondria superoxides mediates angiontension Ⅱ-induced synthesis of extracelluar matrix

WANGJun-ling，YUChen

(Dept. of Nephrology, Tongji Hospital, Tongji University， Shanghai 200065, China)

renal fibrosis； angiotensin Ⅱ； reactive oxygen； superoxides； NADPH oxidase inhibitors； rat

10.16118/j.1008-0392.2016.03.003

2015-09-24

国家自然科学基金(NSFC 81370790)

王均玲(1982—)，女，住院医师，硕士研究生.E-mail: 852775856@qq.com

余 晨.E-mail: yuchen@tongji.edu.cn

R 551

A

1008-0392(2016)03-0016-05