GTA/AVC双重抑制剂对C6脑神经胶质瘤细胞作用的影响

任吉野，秦虹，任吉祥

(1.松原市前郭县中医院，神经内科 吉林 松原 138000；2.长春市中医院 心电超声科， 吉林 长春 130022；3.长春中医药大学附属医院 脑病科，吉林 长春 130021)

GTA/AVC双重抑制剂对C6脑神经胶质瘤细胞作用的影响

任吉野1，秦虹2，任吉祥3Δ

(1.松原市前郭县中医院，神经内科 吉林 松原 138000；2.长春市中医院 心电超声科， 吉林 长春 130022；3.长春中医药大学附属医院 脑病科，吉林 长春 130021)

目的 探讨GTA/AVC双重抑制剂对C6脑神经胶质瘤细胞作用的影响。方法 C6脑神经胶质瘤细胞采用不同浓度GTA/AVC双重抑制剂(1 000、1 500、2 000 μg/mL)处理不同时间(12、48、72 h)，MTT法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞周期的变化。结果 GTA/AVC双重抑制剂对C6脑神经胶质瘤细胞具有明显的抑制作用，并在48 h作用最为明显。GTA/AVC双重抑制剂(2 000 μg/mL)能显著升高G0/G1期细胞的比率，降低S期细胞比率；细胞凋亡率明显高于空白对照组及GTA/AVC双重抑制剂 (1 000 μL/mL) 治疗组 (P<0.05)。结论 GTA/AVC双重抑制剂可能通过调节细胞周期进程，抑制细胞增殖，发挥抗肿瘤细胞生长作用。

GTA/AVC双重抑制剂；C6神经胶质瘤细胞；流式细胞术

脑胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，约占颅内肿瘤的80%，预后差且易复发[1]。目前国内外对于该病的治疗仍以手术和放、化疗相结合为主，由于脑胶质瘤侵袭性生长，手术很难彻底切除，术后极易复发；而放、化疗对脑胶质瘤细胞缺乏特异性；大多数化疗药物不仅易产生耐药性，同时会对人体的正常组织产生不良的影响[2]。迄今为止，国内外已研究的抗肿瘤药物众多，但多数价格昂贵且不良反应大。同时也存在耐药性问题，使其临床应用受到一定限制[3-5]，随着医学实践不断发展及探索发现许多生物活性肽对抑制肿瘤细胞增殖和转移有良好的功效，且具有选择性高、不良反应小等优点[6-8]。为此，寻找高效、低毒、价廉并对人体损伤较小的抗肿瘤活性肽治疗的药物成为近年来研究的热点。本实验采用的GTA/AVC双重抑制剂为本研究室设计并合成，研究其对C6神经胶质瘤细胞作用的影响，并通过检测对神经胶质瘤细胞增殖及细胞周期等变化，初步探讨其抑制神经胶质瘤细胞可能作用的机制，为进一步研究在临床上治疗神经胶质瘤提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、主要试剂及药品:脑神经胶质瘤C6细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

细胞周期检测试剂盒(产品编号：C1052) 由江苏碧云天生物技术研究所产品；二甲基亚砜 、四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 均为 美国Sigma 公司产品；标准胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司，批号：TBD31HB)；GTA/AVC双重抑制剂，由上海吉尔公司合成，纯度为98%；卡莫司汀购自天津金耀药业有限公司(批号：1407011)。

1.1.2 主要仪器：NiKon ECLIPSE 80i荧光显微镜(日本尼康公司)；NCO-15AC 二氧化碳培养箱 (日本三样电机株式会社；BSC-BOOⅡB2 AN YANG 超净台 (苏州安洋科技发展有限公司；guava easyCyte 6HT-2L流式细胞仪(默克密理博中国)；MODEL550型酶标仪(上海BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测细胞存活率：取对数生长期C6细胞，加入0.25% 胰酶2 mL消化；用PBS终止消化；离心，1 500 r/min，5 min； 弃上清，细胞计数，细胞浓度为1×104/mL； 细胞接种至96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，终体积200 μL；待细胞贴壁后，随机分为空白对照组、卡莫司汀组及不同浓度GTA/AVC双重抑制剂1 000、1 500、2 000 μg/mL组，20 μL/每孔，空白对照组加入等体积的培养液，每组分别设8个复孔。置入37 ℃、5%CO2培养，分别孵育24、48、72 h，每孔加入20 μL MTT孵育4 h，以DMSO每孔150 μL终止反应。将96孔板移入平板振荡器，水平振荡10 min。用酶联免疫检测仪于490 nm波长测定吸光度(A)值，以空白对照孔A值调零，记录结果。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞周期：细胞经药物处理48 h后，收集细胞，加入冰冷的磷酸盐缓冲液， 将细胞轻轻吹打成单个细胞，离心，PBS洗2次，用500 μLPBS从悬细胞，每离心管中加入(各100 μL 1 mg/mL PI、10 mg/mL RNaseA、0.01%TritonX-100)，37 ℃避光染色30 min。采用流式细胞仪测定细胞周期变化，本实验重复3次，结果以各个细胞周期所占的百分率表示。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞活性 结果显示，不同剂量GTA/AVC双重抑制剂作用C6脑胶质瘤细胞在24h时，各实验组显微镜下观察细胞呈梭形。各实验组之间抑制的作用也无显著性差异。在48 h时，GTA/AVC双重抑制剂对C6细胞具有明显的抑制作用，空白对照组略呈旋涡状生长，GTA/AVC双重抑制剂 2 000 μg/mL 组与正常对照组及1 000 μg/mL组比较具有显著性差异(P<0.05)；在72 h时，各实验组细胞生长均加快，均呈现旋涡状生长。其中，卡莫司汀组和GTA/AVC双重抑制剂组的细胞生长较空白对照组细胞生长略微缓慢。提示，细胞生长 72 h， GTA/AVC双重抑制剂对C6细胞生长无抑制作用。结果见图1、表1。

图1 GTA/AVC双重抑制剂对C6细胞活性的影响(20×)Fig.1 Effects of GTA/GVA double inhibitor on the activity of C6 cells(20×)

组别抑制率(%)24h48h72h正常对照组0 201±0 0340 247±0 0370 250±0 043卡莫司汀组0 194±0 0300 193±0 034∗0 221±0 039GTA/AVC双重抑制剂1000μg/mL0 201±0 0250 231±0 0630 218±0 032GTA/AVC双重抑制剂1500μg/mL0 199±0 0370 194±0 036∗0 212±0 025GTA/AVC双重抑制剂2000μg/mL0 200±0 0280 183±0 035∗#0 215±0 023

*P<0.05，与正常对照组比较，compared with normal group；#P<0.05，与1 000 μg/mL组比较，compare with 1000 μg/mL group

2.2 GTA/AVC双重抑制剂对C6神经胶质瘤细胞周期变化的影响 研究显示，GTA/AVC双重抑制剂作用48 h能够引起C6胶质瘤细胞周期发生明显改变，GTA/AVC双重抑制剂2 000 μg/mL组与正常对照组比较及1 000 μL/mL组比较G0/G1期比率明显升高，S期细胞数比率下降，比较差异有统计学意义(P<0.05)；GTA/AVC双重抑制剂2 000 μL/mL组与卡莫司汀组比较无统计学意义。表明GTA/AVC双重抑制可明显抑制C6胶质瘤细胞的进程。见图2、表2。

图2 GTA/AVC双重抑制剂对C6细胞周期的影响Fig.2 Effects of GTA/AVG double inhibition on the cell cycle of C6 cells

G0/G1SG2/M正常对照组46 41±8 5749 67±8 943 92±4 00卡莫司汀组62 68±2 9836 23±3 491 08±0 55GTA/AV双重抑制剂1000μg/mL52 88±2 7144 36±0 342 78±2 63GTA/AV双重抑制剂1500μg/mL58 82±1 7040 09±2 321 10±0 65GTA/AV双重抑制剂2000μg/mL67 75±3 27∗#28 88±2 32∗2 77±2 09

*P<0.05，与正常对照组比较，compared with normal group；#P<0.05，与1 000 μg/mL组比较，compared with 1 000 μg/mL group

3 讨论

神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，预后较差。其发病率近年来有所升高，且其发病群体呈现年轻化趋势[9]。胶质瘤对机体最大的影响是其对脑组织的压迫症状。在临床胶质瘤的治疗中，手术是其首选的治疗方法。但手术并不能彻底清除胶质瘤，因胶质瘤本身增殖迅速，且侵袭性强，故术后依然会有部分侵袭到远处的胶质瘤细胞，这些胶质瘤细胞又会在短期内迅速增殖，形成新的胶质瘤团块而产生新的压迫症状[10]。因此，胶质瘤患者术后均要常规进行针对残留胶质瘤细胞的辅助治疗。目前临床常用的辅助治疗措施依然是放、化学治疗，但此2种治疗方法因为副作用大，患者往往不能耐受[11]。为此，寻找高效、低毒、疗效稳定的抗肿瘤药物仍是目前研究开发的热点，而多肽药物恰恰具备了这些优点。

肿瘤的发生是多途径、多步骤的，还与细胞凋亡有关，细胞增殖与凋亡之间的平衡失调与肿瘤的发生、发展密切相关。因此，抑制肿瘤细胞周期的进程及肿瘤细胞增殖，已成为肿瘤治疗的重要手段之一[12-15]。本实验选用MTT法及流式细胞术检测细胞增殖及诱导凋亡情况，结果显示，GTA/AVC双重抑制剂对C6脑神经胶质瘤细胞增殖具有抑制作用，并在48 h作用最为明显，镜下可见空白对照组细胞生长状态良好，GTA/AVC双重抑制剂2 000 μL/mL组较空白对照组及GTA/AVC双重抑制剂 1 000 μL/mL组抑制作用更强，比较差异有统计学意义(P<0.05)。表明GTA/AVC双重抑制剂2 000 μL/mL组细胞生长受到明显抑制。

据文献报道，肿瘤细胞的基本生物学特性表现为细胞的分化与增殖调控失常[16]。近年来研究发现细胞周期调控异常与多种恶性肿瘤发生、发展和预后密切相关。结果表明，GTA/AVC双重抑制剂与卡莫司汀诱导C6脑胶质瘤细胞的凋亡，均可使G0/G1期细胞百分数增加；GTA/AVC双重抑制剂2 000 μL/mL组与卡莫司汀组比较差异无统计学意义，GTA/AVC双重抑制剂2 000 μL/mL组与GTA/AVC双重抑制剂1 000 μL/mL组比较差异有统计学意义(P<0.05)，且S期细胞百分数减少，表明进入DNA合成期的细胞减少。因此，推测GTA/AVC双重抑制剂对C6肿瘤细胞生长是通过阻滞G0/G1期细胞，使S期细胞减少，诱导细胞凋亡，并且这种作用表现为具有一定的时间和剂量依赖性。

综上所述，GTA/AVC双重抑制剂可能通过阻断肿瘤细胞DNA的合成与复制，抑制细胞分裂、降低细胞增殖能力，从而抑制肿瘤细胞的生成。

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(编校：吴茜)

Effect of GTA/AVC double inhibitors on C6 brain nerve glima cells

REN Ji-ye1, QIN Hong2, REN Ji-xiang3Δ

(1.Department of Traditional Chinese Internal Medicine, Qian Guo County Hospital of Traditional Chinese Medicine, Songyuan 138000; China; 2.Department of Electrocardio-ultrasound, Changchun City Hospital of Traditional Chinese Medicine, Changchun 130021, China; 3.Department of Encephalopaty,Affiliated Hospital of Changchun University of Tradtional Chinese Medicine, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo study the effect of GTA/AVC dual inhibitors on C6 brain nerve glima cells. MethodsMTT method was used to test the brain glioma cells activity of proliferation at different times(12 h,48 h,72 h), and using the flow cytometry to detect the change of cells cycle. ResultsIt has obvious inhibitory effcets on C6 brain nerve glima cells, and it was the most obvious at 48 h. GTA/AVC dual inhibitor(2000 μg/mL)treatment group remarkbly rise the G0/G1 rate of celluar, S-phase cell ratio descend,and the cells apoptosis rate was markedly increased.Compared with the control group and the GTA/AVC dual inhibition (1000 μL/mL)treatment group , were significant difference(P<0.05).Conclusionregulating cells cycle progression.

GTA/GVA double inhibitor; C6 brain nerve glima cells; flow cytometry

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.09.008

任吉野，男，主治医师，研究方向：中医内科学，E-mail：renjy1980@163.com；任吉祥，通信作者，男，副教授，研究方向：中医内科脑病，E-mail：renjx@163.com。

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