心衰合剂对肥大心肌细胞线粒体MAO、COX活性的影响

陈嘉兴，佟彤，杨志海，陈忻Δ

(1.首都医科大学附属北京中医医院 心血管科，北京 10010；2.首都医科大学 中医药学院，北京 100069)

心衰合剂对肥大心肌细胞线粒体MAO、COX活性的影响

陈嘉兴1，佟彤1，杨志海2，陈忻2Δ

(1.首都医科大学附属北京中医医院 心血管科，北京 10010；2.首都医科大学 中医药学院，北京 100069)

目的 通过大鼠原代心肌细胞培养，探讨心衰合剂对肥大心肌细胞线粒体功能的影响。方法 培养大鼠原代心肌细胞，应用血管紧张素II(AngII)造模，采用ELISA法检测心肌细胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde,MDA)、单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)及环氧化酶(cyclooxygenase，COX)活性水平，反映线粒体功能及氧化应激损伤情况；Real-time PCR法检测细胞中caspase-3的表达水平。结果 造模后，模型组心肌细胞SOD显著降低，MDA上升，MAO活性升高，COX活性降低，caspase-3 mRNA表达水平显著增加(P<0.01)。含药血清组及空白血清组SOD较模型组均有升高，MDA下降，但含药血清组SOD较空白血清组升高，MAO活性降低，COX活性升高(P<0.05,P<0.01)；含药血清干预后，细胞内caspase-3 mRNA含量与模型组相比显著降低(P<0.01)。含药血清组caspase-3 mRNA表达显著低于空白血清组(P<0.01)。结论 心衰合剂含药血清干预肥大心肌细胞可以显著改善线粒体功能，减轻能量代谢损伤及氧化应激损伤，并通过降低caspase-3的表达水平减轻细胞凋亡，保护心肌细胞。

心衰合剂；肥大心肌细胞；线粒体损伤

慢性心力衰竭的治疗是当前心血管领域研究的热点问题，心肌细胞能量代谢障碍及心肌细胞凋亡是心力衰竭病理过程中的重要组成部分。线粒体是真核细胞重要的细胞器,为产生能量的主要场所。研究显示,线粒体功能障碍在心力衰竭的发生、发展中起着重要作用[1]，线粒体是防治心衰的重要靶点[2]，心衰合剂是由首都医科大学附属北京中医医院心血管科许心如教授结合中医经典理论和临床实践研制而得，既往研究显示，心衰合剂具有改善心肌梗死后大鼠心功能，减轻内质网应激等作用[3-5]。本研究通过心衰合剂含药血清干预肥大心肌细胞，观察其对心肌细胞线粒体功能的影响，从线粒体心肌能量代谢的角度，探讨心衰合剂治疗心力衰竭的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SD大鼠40只，SPF级，雄性，体质量(200±20)g，6～8 w；新生1～3 d SD大鼠30只，雌雄不限。以上大鼠均购于北京维通利华实验动物有限公司，合格证号：SCXK(京)2012-0001。本动物实验遵循《实验动物保护条例》相关规定。

1.1.2 药物:心衰合剂：黄芪30 g，太子参30 g，葶苈子15 g，桑白皮15 g，车前子10 g，赤芍10 g，水红花子10 g。由首都医科大学附属北京中医医院制剂室提供。按照临床等效剂量换算，用蒸馏水配置成0.825 g/mL溶液备用。

1.1.3 试剂:1640培养基(GIBCO);胎牛血清(FBS,GIBCO); 血管紧张素II(AngII)、DMSO(Sigma); Ⅱ型胶原酶、PBS、MTT检测试剂盒(锐尔康生物)；超纯RNA提取试剂盒、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture(With ROX)、DNase Ⅰ、5×RNA Loading Buffer(CWbio.Co.Ltd)。

1.1.4 仪器:MultiSkan3酶标仪(Thermo)；NANODROP 2000分光光度计(Therno scientific)；ABI7500荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)；MCO-15AC型二氧化碳培养箱(SANYO)；XDS-2B型倒置显微镜(重庆光电)；SW-CJ-1D型超净台(江苏通净)；QL-902涡旋振荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；Centrifuge 5415D离心机(Eppendorf)；Fresco低温冷冻离心机(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 含药血清的制备：Wistar鼠20只，随机分为2组：给药组灌胃给予心衰合剂0.825 g/mL，2 mL/100 g，空白组给予等量0.9%NaCl溶液；灌药前禁食不禁水12 h，每天给药2次(8 am，5 pm)，连续给药5 d，最后一次给药1～2 h后，0.4%戊巴比妥钠腹腔麻醉，无菌腹主动脉取血(5～7 mL/只)，室温静置2 h后，3 000 r/min离心10 min，无菌条件分离血清；将每组血清混匀，56 ℃，30 min灭活，-20 ℃保存备用。

1.2.2 原代心肌细胞分离鉴定：取出生1～3 d的SD大鼠30只，消毒后开胸取出心脏，立即放入预冷的PBS缓冲液中，吹打2次洗净血液，弃PBS缓冲液；将心脏组织剪成5 mm×5 mm×5 mm大小，加入37 ℃预热的0.1%的Ⅱ型胶原酶，加入量为心肌组织体积20倍，消化15 min，至组织块粘连在一起，并伴有絮状物质。加入含10%胎牛血清(FBS)的1640培养基，反复吹打组织至不粘稠，200目的细胞筛过滤收集得到细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，将细胞重悬到含10%FBS的1640培养基中，加入至100 mm的细胞培养皿内，自然沉降90 min，去除成纤维细胞。调整细胞密度至1×106个/mL，接种到新的100 mm细胞培养皿内。5%CO2、37 ℃培养48 h后，更换新的完全培养基。

1.2.3 细胞造模及给药方法：造模方案：对照组细胞不做任何处理，加入无血清培养基。模型组加入终浓度为1×10-6mol/L的AngII造模24 h。空白血清组加入10%空白血清培养24 h后，加入浓度为1×10-6mol/L的AngII造模24 h。含药血清组：加入10%心衰合剂含药血清培养24 h后，加入浓度为1×10-6mol/L的AngII造模24 h。每组设置6个复孔。

1.2.4 SOD、MDA、MAO、COX检测：将细胞沉淀按1×106个细胞：100 μL PBS比例重悬后，-20 ℃冻存过夜，隔天室温复融；重复2～3次冻融后，10 000 r/min离心5 min，收集上清用于按照ELISA试剂盒说明进行检测。

1.2.5 Real-time PCR检测：Caspase-3引物序列上游为:5’-ACTGGAAAGCCGAAACTCTTCATCA -3’；下游为:5’-GGAAGTC GGCCTCCACTGGTATC -3’；GAPDH引物序列上游为：5’-TGG AGTCTACTGGCGTCTT-3’，下游为:5’-TGTCATATTTCTCGTGGT TCA-3’，预计扩增片段长度为127 bp。

提取细胞样本总RNA并检测RNA完成性，用DNase Ⅰ试剂盒对RNA中残留的基因组DNA进行消化处理。用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒进行反转录。PCR反应条件：95°10 min，(95 ℃15sec，60 ℃60sec)×45个循环。

2 结果

2.1 心衰合剂对肥大心肌细胞SOD、MDA的影响 经过AngⅡ造模后，模型组心肌细胞SOD显著降低，MDA升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。含药血清组及空白血清组较模型组SOD均有升高，MDA下降，但含药血清组SOD升高较空白血清组显著(P<0.01)，2组间MDA未见明显差异。见表1。

表1 心衰合剂对肥大心肌细胞SOD、MDA的影响

**P<0.01，与对照组比较，compared with control group；##P<0.01，与模型组比较，compared with model group；△△P<0.01，与空白血清组比较，compared with blank serum group

2.2 心衰合剂对肥大心肌细胞MAO、COX的影响 模型组细胞内MAO活性升高(P<0.01)，线粒体COX活性降低(P<0.01)；含药血清组及空白血清组较模型组相比，MAO活性降低，COX活性升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。含药血清组与空白血清组相比，其MAO活性显著下降(P<0.01)，COX活性升高(P<0.01)。见表2。

表2 心衰合剂对肥大心肌细胞MAO、COX的影响

**P<0.01，与对照组比较，compared with control group；##P<0.01，与模型组比较，compared with model group；△P<0.05，△△P<0.01，与空白血清组比较，compared with blank serum group

2.3 心衰合剂对肥大心肌细胞caspase-3表达水平的影响 模型组心肌细胞caspase-3 mRNA较对照组表达显著增加(P<0.01)。含药血清组细胞caspase-3 mRNA含量显著低于模型组(P<0.01)。含药血清组caspase-3 mRNA表达显著低于空白血清组(P<0.01)。见表3。

表3 心衰合剂对肥大心肌细胞caspase-3的影响

**P<0.01，与对照组比较，compared with control group；##P<0.01，与模型组比较，compared with model group；△△P<0.01，与空白血清组比较，compared with blank serum group

3 讨论

心力衰竭是各种原因导致的心脏功能下降，也是心血管病治疗的最后战场。当各种原因导致心脏压力或容量负荷过重时,心肌细胞无法维持正常的心输出量以保证组织灌注，通过一系列的神经内分泌系统变化进行代偿，为了维持收缩压和心脏壁厚度/心室半径比之间的恒定，心肌细胞在神经内分泌各种因子的影响下发生肥厚。但这一改变使得线粒体必须一同增殖从而确保能量的供应与消耗之间的平衡。线粒体的功能决定了其在能量代谢、氧化反应、维持Ca2+稳态及细胞凋亡等方面的重要地位。当心力衰竭发生时，线粒体通过多种方式应对这一变化，以维持细胞存活，当损伤持续加重无法缓解时，线粒体调节作用失代偿，转而促进心肌细胞凋亡。

细胞色素C氧化酶(COX)及单胺氧化酶(MAO)广泛存在于线粒体上,在能量产生中起主要作用[6]。COX活力下降可以导致细胞的ATP水平降低从而启动凋亡，COX活力改变同时可使线粒体内跨膜电位崩溃，而该线粒体膜电位下降使膜电位通透转换孔开放，COX释入胞浆启动Caspase系统导致细胞凋亡[7]。当心脏应激时，心肌组织中MA0可将儿茶酚胺类物质催化生成过氧化氢，是应激时活性氧(R0S)的主要来源。而研究提示ROS能通过多种信号通路介导心肌细胞肥大、细胞外基质(ECM)重构和细胞功能失调[8]。

慢性心力衰竭中医常列入“心悸”、“喘证”、“水肿”等范畴。心肺同居于上焦，在生理上密切关联，同时在病理上也互相影响。故心气不足，则水饮内停，阻于娇脏，这是心衰病的重要病机。患者气虚是本，水停为标，根据病因病机，许心如教授上个世纪60年代在国内首创“泻肺利水法”，并以《金匮要略》葶苈大枣泻肺汤和防己黄芪汤为主方研制心衰合剂。课题组既往多项临床、基础研究显示，心衰合剂具有扩张血管、利尿、正性肌力作用、调节神经内分泌功能、防止细胞发生凋亡等作用[9-12]。

本项实验显示，心肌细胞经过AngII培养后出现了线粒体功能上的损害以及能量代谢的异常。模型组细胞MAO上调、COX下降，并出现了氧化应激反应，伴随COX的活力改变，caspase-3表达含量显著增加，致使心肌细胞发生凋亡。通过心衰合剂含药血清可以降低MAO水平，并上调COX活性，减轻心肌细胞线粒体功能损伤，调节心肌细胞能量代谢，抑制ROS的生成，并降低caspase-3的表达水平从而保护心肌细胞。

[1] 熊燕,海春霞.线粒体功能障碍与心血管疾病[J].中国药理通讯,2008,25(2):38-39.

[2]孙锴，王克强，葛均波，等．线粒体是防治心力衰竭的重要靶点[J]．中华心血管病杂志，2008,36(9):854-858.

[3]佟彤,尚菊菊,解欣然,等.心衰合剂对肥大心肌细胞凋亡及乳酸脱氢酶漏出率的影响[J].中华中医药杂志,2013,10:3086-3088.

[4]佟彤,尚菊菊,刘红旭,等.心衰合剂对大鼠心肌细胞肥大模型内质网应激因子Grp78、Caspase-12表达的影响[J].北京中医药,2015,34(3):173-175.

[5]戴梅,温庆祥,何俊仁,等.心衰合剂对心肌梗死后心力衰竭大鼠的影响[J].中国中医药信息杂志,2006,13(12):28-30.

[6]江海洪,谢燕,刘倩予.细胞色素C氧化酶的分子生物学研究进展[J].国外医学:生理、病理科学与临床分册,2001,21(1):20-22.

[7]王苏华,张薇,邢光伟,等.细胞色素C氧化酶活力测定方法概况[J].毒理学杂志,2010,24(5):412-414.

[8]Tsutsui H,Kinugawa S,Matsushima S.Oxidative stress and heart failure[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2011,301(6):H2181-2190.

[9]安海英,黄丽娟,金敬善,等.益气温阳和活血利水法对充血性心力衰竭患者神经内分泌系统的影响[J].中国中西医结合杂志,2002,22(5):340-352.

[10]金玫,黄丽娟,王振裕,等.心衰合剂对慢性心力衰竭的干预[J].北京中医,2003,22(3):10-12.

[11]黄丽娟,王倩,金玫,等.益气活血温阳利水法治疗慢性充血性心力衰竭[J].中国自然医学杂志,2000,2(2):79-82.

[12]戴梅,温庆祥,何俊仁,等.心衰合剂对心力衰竭患者血管紧张素Ⅱ、心钠素和N终端脑钠素前体的影响[J].中国中西医结合杂志,2006,26(10):888-891.

(编校：王俨俨)

作 者 简 介

陈忻教授，1997～2000年任北京联合大学中医药学院药理教研室主任，2000～2001年进入日本新澙药科大学放射化学教研室交流，2002年起进入首都医科大学中医药学院从事中药药理教学与相关研究,2006～2015担任系主任。

陈忻教授从事药理、中药药理的教学及科研30余年，中华中医药学会中药实验药理分会专业委员会委员，北京自然科学基金、国家科学技术奖评审专家，中国药理学会会员。近5年主持北京市教育委员会面上项目2项，研究方向主要为中药对帕金森病神经保护作用的基础研究，在鱼藤酮帕金森病模型研究以及黄芩苷等中药有效成分保护多巴胺神经及作用机制研究上取得进展。国内外刊物第一作者或责任作者发表论文近60余篇(SCI收录9篇)。主持首都医科大学科技基金及教改课题3项；在高等医学教育、中药学学科建设和教学改革上颇有见解，并有多篇教改论文发表，近年主持多项校级中药专业研究生培养和中药本科专业建设质量工程项目。参加编写国家十一五、十二五规划教材《药理学》《中药药理学》《临床药学》等共7本，配套教材3本，专著2部，主编自编教材2本。

Effect of Xinshuai mixture on MAO and COX activity in hypertrophy myocardial cell

CHEN Jia-xing1, TONG Tong1, YANG Zhi-hai2, CHEN Xin2Δ

(1.Department of Cardiology, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100010, China; 2.School of Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China)

ObjectiveTo study the effects of Xinshuai mixture on mitochondrial function of hypertrophy cardiomyocyte cellinvitro.MethodsThe primary neonatal rat myocardial cells were cultured to establish hypertrophic myocardial model by AngII.The levels of superoxide dismutase(SOD), methane dicarboxylic aldehyde (MDA), monoamine oxidase(MAO) and cyclooxygenase (COX) were detected by ELISA, as the mitochondrial function and oxidative stress damage.The expression level of caspase-3 mRNA was detected by Real-time PCR.ResultsCompared with control group, the SOD level in model group reduced markedly, MDA level increased significantly, the activities of MAO increased, the activities of COX decreased, the expression of caspase-3 level increased significantly(P<0.01).Compared with the model group, the SOD level increased and MDA level decreased in Xinshuai mixture group and blank serum group.But the SOD level and activities of MAO, COX in Xinshuai mixture group and blank serum group had significant difference(P<0.05,P<0.01).The expression of caspase-3 mRNA level in Xinshuai mixture was significantly higher than the blank serum group(P<0.01).ConclusionXinshuai mixture could significantly improve the fuction of mitochondrial in hypertrophy cardiomyocyte cell, reduce the energy metabolism and oxidative stress injury, and protect cardiac myocyte through lower the expression of caspase-3.

Xinshuai mixture; hypertrophy cardiomyocyte cell; mitochondria damage

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.09.005

首都医科大学2014年基础临床科研合作基金课题(14JL82)；首都医科大学附属北京中医医院院内课题育苗计划(2014YM-14)

陈嘉兴，男，硕士，副主任医师，研究方向：中西医结合心血管病，E-mail：cjx710704@sina.com；陈忻，通信作者，女，教授，研究方向：中药药理，E-mail：chenxin4283@126.com。

R541.6+1；R285.5

A