猪肉组织及尿液中莱克多巴胺的快速检测

党 娟，李 平，牛治存，王大敏，何国书，2，冯才伟

（1.贵州勤邦食品安全科学技术有限公司，贵州贵阳550009；2.北京勤邦生物技术有限公司，北京100012）

畜牧·兽医·水产

猪肉组织及尿液中莱克多巴胺的快速检测

党 娟1，李 平1，牛治存1，王大敏1，何国书1，2，冯才伟1

（1.贵州勤邦食品安全科学技术有限公司，贵州贵阳550009；2.北京勤邦生物技术有限公司，北京100012）

为实现猪肉组织中莱克多巴胺残留大量样本的快速检测，选用莱克多巴胺酶联免疫吸附（ELISA）、化学发光微粒子免疫（CMIA）检测试剂盒对猪肉、猪肝和尿液3种样品中莱克多巴胺残留量进行检测，并与国家标准检测气相色谱－质谱法（GC－MS）进行比较。结果表明：ELISA、CMIA这2种试剂盒对猪肉、猪肝、尿液样品在莱克多巴胺0.5μg／kg和1.0μg／kg 2个水平的平均回收率达90.4%～103.4%，变异系数均小于10%；对猪肉、猪肝和尿液3种样品的最低检测限分别为0.28μg／kg、0.33μg／kg和0.12μg／kg，0.45μg／kg、0.50μg／kg和0.20μg／kg；2种试剂盒与GC－MS检测实际样品的判断结果一致，且检测时间短，仅需少量仪器，检测准确度高，适合大批量样品检测。

莱克多巴胺；酶联免疫吸附法；化学发光微粒子免疫法；气相色谱－质谱法

β－兴奋剂是营养重分配剂的一种，是一类结构及功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙醇胺类衍生物，莱克多巴胺（Ractopamine，RAC）属于β－兴奋剂，可以加快畜禽生长速度，降低酮体脂肪含量，提高瘦肉率［1－3］。β2－肾上腺素受体激动剂的结构、作用与肾上腺素和去甲肾上腺素相似，由芳香环、β－羚基和脂肪氨基3个活性基团组成。这些基团形成的特异性结构构成了与β－AR的结合位点。这些药物的作用机理是与组织细胞如血管平滑肌、细支气管平滑肌的β2受体结合，激活细胞膜上的腺昔酸环化酶，引起细胞产生一系列变化，导致气管、支气管平滑肌松弛，骨骼肌收缩，血管平滑肌松弛，过敏介质释放减少，并增加呼吸道纤毛运动，促进痰液排出，最初用来治疗呼吸系统疾病［4－8］。但过量使用莱克多巴胺会残留在畜禽肌肉组织中，对人体健康产生毒副作用，如心跳加快和呼吸困难等症状［9－10］；对鼠的毒性属于低毒级［11］。

在欧盟，β－兴奋剂已被禁止作为家禽的生长促进剂［12］，我国也禁止在饲料和饮用水中使用，如：莱克多巴胺、盐酸克仑特罗、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、盐酸多巴胺、西吗特罗和硫酸特布他林等［13］。但由于莱克多巴胺属于非处方药，且价格远低于克仑特罗，因此其非法应用者不断增多。目前，应用于β－兴奋剂的检测方法主要是经典的色谱法和免疫分析法。为检验北京勤邦生物技术有限公司生产的酶联免疫（ELISA）试剂盒、化学发光微粒子免疫（CMIA）试剂盒的检测效果，分别采用ELISA和CMIA 2种方法对猪肉组织、尿液中莱克多巴胺进行检测，并与气相色谱－质谱（GC－MS）法比较，以期实现猪肉组织中莱克多巴胺残留大量样本的快速检测以及该试剂盒的推广应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

样品：猪肉、猪肝脏和猪尿液，采自贵阳某屠宰场。

试剂：莱克多巴胺ELISA检测试剂盒，莱克多巴胺CMIA检测试剂盒（北京勤邦生物技术有限公司），莱克多巴胺标准品（美国Sigma公司），甲醇（色谱纯，天津市富宇精细化工有限公司），丙酮、异丙醇、甲苯、乙酸乙酯、浓硫酸、浓盐酸、高氯酸和浓氨水等（均为分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）。

1.2 仪器

磁免疫全自动化学发光检测仪（北京勤邦生物技术有限公司），酶标分析仪（Multiskan MK3，美国Thermo公司），高速电动匀浆机（FSH－Ⅱ型，江苏中大仪器厂），恒温振荡器（CHZ－82A，上海百典仪器设备有限公司），高速离心机（GT16－3A，北京时代北利离心机有限公司），涡旋仪（QL－901，海门市其林贝尔仪器制造有限公司），天平（ESJ200－4，沈阳龙腾电子有限公司），微量移液器（单道20～200μL、100～1 000μL，多道250μL，美国Thermo公司），GC－MS气质联用仪〔ISQ，赛默飞世尔科技（中国）有限公司〕。

1.3 样品前处理

1.3.1 ELISA样品

1）尿液。取20μL清亮尿样直接测定（如尿样浑浊必须通过过滤，或在20～25℃、3 000r／min以上离心10min，直至清亮）。

2）猪肉／猪肝。用均质器均质猪肉或肝脏样本，称取（2.0±0.05）g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入2%NaCl－0.2mol／L HCl－甲醇混合液4mL，3 000r／min以上振荡30s，取0.5mL上清液，加入0.5mol／L氢氧化钠溶液30mL，再加入复溶液0.5mL，20～25℃、3 000r／min离心10min；取20μL上层溶液用于分析。

1.3.2 CMIA样品

1）尿液。其处理方法同ELISA样品尿液前处理。

2）猪肉。用均质器均质猪肉样本，称取（2.0± 0.05）g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入提取工作液（试剂1：量取浓盐酸4.15mL，加入去离子水定容至500mL；试剂2：称取十二水合磷酸氢二钠0.44g、二水合磷酸二氢钠1.37g，加入500mL去离子水溶解混匀；试剂3：量取4mL试剂1、40mL试剂2和16mL甲醇混匀），然后再加入6mL试剂3，用涡旋仪涡动2min，然后20～25℃、3 000r／min以上离心5min；取500μL上清液加入750μL复溶工作液，用涡旋仪涡动20s，用于分析。

3）猪肝。用均质器均质肝脏样本，称取（2.0± 0.05）g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入0.25mol／L硫酸1mL和甲醇2mL，涡动2min，在20～25℃、3 000r／min以上离心5min；取200μL上清液加入600μL复溶液（用去离子水将2×浓缩复溶液按1∶1体积进行稀释），涡动20s，用于分析。

1.4 样品检测

1.4.1 ELISA将所需试剂放于20～25℃平衡30min以上，使用前摇匀。加标准品／样本20μL到对应的微孔中，每孔加入酶标二抗浓缩液与抗体工作液（10∶1）的混合液80μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。然后小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250μL／孔充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干，加底物液A液50μL／孔，再加底物液B液50μL／孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光反应10min，加入终止液50μL／孔，轻轻振荡混匀，用酶标仪于450nm处测定。

1.4.2 CMIA将所有试剂回升至20～25℃，酶标抗原浓缩液与酶标抗原稀释液按1∶10体积进行稀释，磁标抗体浓缩液与磁标抗体稀释液按1∶10体积进行稀释，将稀释好的磁标抗体与酶标抗体工作液装入试剂盒标示区，再把样品和标准品分别放入样品管和标准品管，并放于磁免疫全自动化学发光检测仪设定区域进行检测。

1.5 标准曲线绘制及莱克多巴胺浓度的计算

测定0μg／L、0.05μg／L、0.15μg／L、0.45μg／L、1.35μg／L和4.05μg／L 6个浓度标准液的吸光度值（A）和发光度值（RLU），计算百分吸光率。

百分吸光率＝B／B0×100%

式中，B为标准品或样品溶液的平均吸光度值，B0为标准溶液的平均吸光度值。

以莱克多巴胺浓度对数值（Log）为横坐标，各对应浓度的百分吸光率为纵坐标，制作标准曲线；以莱克多巴胺标准品浓度的对数（Log）为横坐标，ln百分吸光率为纵坐标建立双对数直线拟合曲线，数学模型：

将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应浓度（C），乘以其对应稀释倍数即为样品中莱克多巴胺的实际浓度。

1.6 试剂盒性能检测

分别对试剂盒的特异性、检测限、精密度和准确度进行试验，并将其精密度和准确度与HPLC检测的精密度和准确度进行对比。

1.6.1 特异性 用交叉反应率来表示，即抗体与结构不同抗原决定簇发生结合的能力。选择与莱克多巴胺类似结构和功能的药物，将不同浓度的莱克多巴胺类似物替代莱克多巴胺标准溶液，根据其标准曲线，并计算交叉反应率。

交叉反应率＝引起50%抑制的莱克多巴胺浓度／引起50%抑制的莱克多巴胺类似物浓度× 100%

1.6.2 检测限 分别对空白猪肉、猪肝和尿液样品进行20次检测，计算莱克多巴胺的浓度。检测限（LOD，即试剂盒检测实际样品的最低检测限）公式：

式中，X为莱克多巴胺的浓度平均值，SD为标准差。

1.6.3 精密度和准确度 精密度又称可重复性，反映测定方法对某一特定样品多次测定所得结果的重复程度，是评定化学发光试剂盒质量最基本的参数。准确度是指测定值与真实值间的符合程度，试剂盒的准确度用回收率表示。在检测为阴性的猪肉、猪肝和尿液样本中添加莱克多巴胺，每种样品、每个浓度各6个平行，参照试剂盒说明书测定。抽取3批试剂盒，每批试剂盒测定同一份样品2次，分别计算测定样品的回收率。

1.6.4 试剂盒与GC－MS检测结果比较 随机抽取屠宰场的猪肉、猪肝和尿液样本各20份，分别用试剂盒方法和GC－MS法进行检测，GC－MS法参考农业部958号公告－4－2007动物组织及尿液中莱克多巴胺残留检测方法。GC－MS法中猪肉和猪肝（5μg／kg）、尿液（2μg／kg）的检测限为阳性判定线。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

从图示可知，ELISA标准曲线的回归方程y＝－1.782 8x＋4.224 9，R2＝0.996 2，说明莱克多巴胺ELISA检测试剂盒线性关系良好。CMIA标准曲线的回归方程y＝－1.725 4x＋4.149 4，R2＝0.997 5，说明莱克多巴胺CMIA检测试剂盒线性关系良好。

2.2 试剂盒性能

2.2.1 特异性 从表1可知，莱克多巴胺类似代谢物的交叉反应率均较低，抗体特异性较高，对莱克多巴胺具有较好的特异性。

图示ELISA（上）和CMIA（下）的标准曲线及其方程Fig. The standard curve and equation of ELISA（up）and CMIA（down）

表1 莱克多巴胺类似物的交叉反应率Table 1 Cross reactivity of ractopamine analogues%

表2 莱克多巴胺试剂盒的最低检测限Table 2 Minimum detection limit of ractopamine kits

2.2.2 检测限 从表2看出，ELISA和CMIA试剂盒对猪肉、猪肝和尿液3种样品的最低检测限分别为0.28μg／kg、0.33μg／kg和0.12μg／kg，0.45μg／kg、0.50μg／kg和0.20μg／kg，均低于目前欧盟对莱克多巴胺检测方法的灵敏度（1μg／kg）［11］，说明这2种试剂盒检测限较低，试剂盒灵敏度较高。

表3 莱克多巴胺试剂盒的准确度与精密度Table 3 Precision and accuracy of ractopamine kits

表4 不同方法检测的莱克多巴胺含量Table 4 Ractopamine contents detected with different methodsμg／kg

2.2.3 精密度和准确度 从表3可知，3种样品的回收率在90.4%～103.4%，变异系数均小于10%，符合“农业部文件”农医发［2005］17号附件2中试剂盒备案的参考标准。

2.2.4 试剂盒与GC－MS法检测比较 对随机抽取屠宰场的猪肉、猪肝和尿液样本各20份进行检测，其中7号、12号样本的莱克多巴胺（表4）高于检出线，其他样本无检出。ELISA、CMIA试剂盒检测结果与GC－MS法检测结果相当，表明这2种试剂盒检测的准确度达到国家标准检测水平。

3 结论

测定结果表明，ELISA和CMIA检测试剂盒对莱克多巴胺类似物的交叉反应率很低，对莱克多巴胺的特异性很高。ELISA和CMIA试剂盒对猪肉、猪肝和尿液样品中莱克多巴胺的最低检测限分别为0.28μg／kg、0.33μg／kg和0.12μg／kg，0.45μg／kg、0.50μg／kg和0.20μg／kg；在莱克多巴胺0.5μg／kg和1.0μg／kg 2个水平的平均回收率为90.4%～103.4%，变异系数均小于10%；且2种试剂盒所需的检测时间短，仅需少量仪器，检测准确度达到国家标准检测水平，适合大批量样品检测。

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（责任编辑：冯 卫）

Rapid Detection of Ractopamine in Pork Tissues and Urine

DAND Juan1，LI Ping1，NIU Zhicun1，WANG Damin1，HE Guoshu1，2，FENG Caiwei1
（1.Guizhou Kwinbon Food Safety Science－Technology Co.，Ltd，Guiyang，Guizhou550009；2.Beijing Kwinbon Biotechnology Co.，Ltd，Beijing100012，China）

To realize the rapid detection of large－quantity samples of ractopamine residue in pork tissues，the methods of ELISA and CMIA were used to detect the residues of ractopamine in three kinds of samples including pork，liver and urine，which were compared with that of Gas Chromatography－Mass Spectrometer（GC－MS）.Results：The average recovery rate of ELISA and CMIA for detecting ractopamine in pork，liver and urine at levels of 0.5μg／kg and 1.0μg／kg reached 90.4%～103.4%with variation coefficient less than 10%；The minimum detection limits of pork，liver and urine were respectively 0.28μg／kg，0.33μg／kg and 0.12μg／kg，0.45μg／kg、0.50μg／kg and 0.20μg／kg；The judgments of ELISA and CMIA were the same as GC－MS.This method was efficient，reliable and sensitive，and could can meet the on－site rapid detection of animal tissue and urine ractopamine residues needs.

ractopamine；melamine enzyme－linked immune sorbent assay（ELISA）；chemiluminescent microparticle immunoassay（CMIA）；gas chromatography－mass spectrometer（GC－MS）

S859.84

A

1001－3601（2016）08－0340－0061－04

2016－02－16；2016－07－07修回

2015贵州省科技厅农业公关项目“农产品质量安全控制技术集成研究与应用示范”［黔科合NY（2015）3016－1］；2014贵州省科技成果转化引导基金计划项目“动物源性食品中兽药残留酶联免疫检测产品产业化及推广应用”［黔科合成转字（2014）5104］

党 娟（1989－），女，工程师，硕士，从事食品安全快速检测技术的研究与开发工作。E－mail：853625823＠qq.com