Fas及FasL在滋养细胞、葡萄胎及绒癌中的表达

肖发菊　黄爱华

[摘 要] 目的：探讨Fas及FasL在滋养细胞、正常葡萄胎、侵袭性葡萄胎、绒癌中的表达及意义。方法：利用免疫组织化学方法检测Fas及FasL蛋白在正常滋养细胞（40例）、完全性葡萄胎（36例）、侵袭性葡萄胎（20例）、绒癌（20例）中的表达；用逆转录PCR（RT-PCR）检测 Fas、FasL基因在4组组织中的表达。结果：免疫组织化学方法显示Fas蛋白在正常滋养细胞组、完全性葡萄胎组、侵蚀性葡萄胎组和绒癌组的阳性表达率分别为90%（36例）、86.1%（31例）、40%（8例）、30%（6例），FasL蛋白在正常滋养细胞组、完全性葡萄胎组、侵蚀性葡萄胎组和绒癌组的阳性表达率分别为17.5%（7例），27.8%（10例）、55%（11例）、75%（15例）。在侵蚀性葡萄胎和绒癌中Fas蛋白低表达、FasL蛋白高表达；PCR结果显示 Fas基因在正常滋养细胞组、完全性葡萄胎组、侵蚀性葡萄胎组、绒癌组中表达量逐渐降低，而FasL基因表达量逐渐升高。结论：在侵蚀性葡萄胎及绒癌中Fas低表达及FasL高表达，这与侵蚀性葡萄胎及绒癌的凋亡机制密切相关。

[关键词] 侵袭性葡萄胎；绒癌；Fas；FasL

中图分类号：R737.3 文献标识码：B 文章编号：2095-5200（2016）03-097-03

DOI：10.11876/mimt201603036

侵袭性葡萄胎与绒毛膜上皮癌（简称绒癌）是妊娠滋养细胞疾病中常见恶性肿瘤[1-3]。滋养细胞来源于胚胎外胚层[4]，当其异常增生，间质水肿，终末绒毛发生转变，形成大小不一水泡，形成葡萄胎。葡萄胎组织侵入子宫肌层或者转移到宫外时，具有恶性潜能即为侵袭性葡萄胎[5]。绒癌也多继发于葡萄胎[6-8]，其恶性程度更高，更易发生全身转移，导致患者死亡。

1989年Yonehara等 [9]发现一种因子可以识别表达于髓样细胞、T淋巴细胞和成纤维细胞表面的未知分子，诱导多种人细胞系发生凋亡，于是将这种因子命名为Fas。随后进一步研究发现Fas、FasL是重要细胞凋亡调控因子，并在多种肿瘤存在异常表达[10-12]。本实验研究Fas、FasL在正常滋养细胞组、完全性葡萄胎组、侵蚀性葡萄胎组和绒癌组表达情况，以RT-PCR检测Fas、FasL基因在正常滋养细胞组、完全性葡萄胎组、侵蚀性葡萄胎组和绒癌组表达情况，为揭示侵蚀性葡萄胎组和绒癌凋亡机制提供资料。

1 材料和方法

1.1 材料

Fas、FasL抗体（福州迈新生物技术有限公司）；DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物公司）； RNeasy FFPE Tissue Kit试剂盒（厦门艾德生物医药科技有限公司）；HiFi-MMLV Two Step RT-PCR Kit （北京康为世纪生物科技有限公司）；Golden view（庄盟国际生物基因科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 标本来源 收集本院2013年 3月至 2015年 9月期间临床资料完整、病理检查诊断明确的116例样本（正常滋养细胞40例、完全性葡萄胎36例、侵袭性葡萄胎20例、绒癌20例）。在上述4组石蜡标本中每种随机选取5例，对每组5例石蜡标本分别提取总RNA，反转成cDNA，用RT-PCR检测Fas、FasL基因在组织中表达。

1.2.2 免疫组织化学实验方法

1）脱蜡和水化。2）抗原修复。3）免疫组织化学染色： 3%H2O2滴加在组织上，室温静置10min；PBS洗3次各5min；滴加正常山羊血清封闭液，室温20min；滴加Ⅰ抗50μL， 4℃过夜；PBS洗3次各5min；滴加Ⅱ抗50μL，37℃20min；PBS洗3次各5min；DAB显色2～3min，在显微镜下掌握染色程度；自来水冲洗5min；苏木精复染3min，盐酸酒精分化3秒；自来水冲洗10min；脱水、透明、封片、镜检。4）结果判读：Fas及FasL 蛋白以胞浆、包膜出现黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞，具体判断标准是按照染色强度和显色细胞占总细胞百分比结合进行评分：阳性强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别记为0、1、2、3分，显色细胞占总细胞百分比<5%、5%～25%、26%～50%、>50%分别记为0、1、2、3分，两项积分相乘，>3分记为阳性。

1.2.3 石蜡组织总RNA提取 使用RNeasy FFPT试剂盒，按照说明书提取各组标本总RNA。经反转体系得到cDNA，用RT-PCR方法检测Fas、FasL基因表达。RT-PCR对Fas、FasL基因引物进行扩增，条件如下：98℃ 10s，56/57℃ 30s，72℃ 30s，40个循环。RT-PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像仪显示，以ActinPCR扩增作为内参。

1.2.4 统计学处理 使用SPSS11.0软件系统，计数资料进行χ2检验或Fishers确切概率法检验，相关比较采用Spearman等级相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学检测Fas、FasL蛋白表达情况

从表1来看，Fas蛋白在正常滋养细胞组、完全性葡萄胎组、侵蚀性葡萄胎组和绒癌组阳性表达率下降，FasL蛋白在正常滋养细胞组、完全性葡萄胎组、侵蚀性葡萄胎组和绒癌阳性表达率依次升高。

2.2 Fas、FasL 基因表达

从图1结果来看，Fas基因在正常滋养细胞组、完全性葡萄胎组、侵蚀性葡萄胎组、绒癌中表达量逐渐降低，FasL基因正常滋养细胞组、完全性葡萄胎组、侵蚀性葡萄胎组、绒癌中表达量逐渐升高。

3 讨论

侵袭性葡萄胎与绒癌[13-14]均起源于葡萄胎。以阴道不规则出血、子宫复旧不全或不均匀增大，偶有腹痛，易发生宫外转移为主要特点。化学疗法是侵袭性葡萄胎与绒癌主要治疗手段[15]，通过联合用药抑制癌细胞增殖。但是在治疗过程中，患者经常出现耐药现象，这种现象与Fas、FasL因子密切相关。

Fas属于坏死因子/神经生长因子分子受体超家族成员[16]，在细胞凋亡及体内免疫调节方面发挥重要作用。FasL属于Ⅱ型跨膜蛋白和肿瘤坏死因子家族成员[17]，能与Fas特异性结合，诱导细胞发生程序性凋亡。但是在恶性肿瘤细胞中Fas低表达或者不表达，避开杀伤性T 细胞表面FasL介导的细胞凋亡，使癌细胞在体内存活下来。在恶性肿瘤细胞表面FasL表达增加，与激活T 淋巴细胞表面 Fas 结合，诱导T细胞凋亡，从而破坏机体免疫系统。

本实验发现Fas蛋白在正常滋养细胞组、完全性葡萄胎组、侵蚀性葡萄胎组和绒癌组阳性表达率逐渐下降，Fas蛋白在正常组表达量明显高于侵蚀性葡萄胎组和绒癌组表达量，FasL蛋白在正常组表达量明显低于侵蚀性葡萄胎组和绒癌组表达量，差异有统计学意义。PCR结果亦显示 Fas基因、FasL基因表达与免疫组化结果相符。说明Fas、FasL与细胞凋亡密切相关。

Fas、FasL 在侵蚀性葡萄胎和绒癌发生和发展中发挥重要作用，研究表明Fas、FasL参与化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡过程，表现出与多种肿瘤的耐药性相关，下一步可针对Fas、FasL基因药物靶向进行深入研究。

参 考 文 献

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