急进高原对大鼠胃电活动及胃Cajal间质细胞微观结构和功能的影响

朱　琳， 贺　巍， 杨生岳， 范兴爱， 刘睿年， 陈　磊

(解放军第四医院消化内科，西宁　810007； *通信作者，E-mail：hewei.1971@163.com)

急进高原对大鼠胃电活动及胃Cajal间质细胞微观结构和功能的影响

朱琳， 贺巍*， 杨生岳， 范兴爱， 刘睿年， 陈磊

(解放军第四医院消化内科，西宁810007；*通信作者，E-mail：hewei.1971@163.com)

摘要：目的探讨急进高原后不同海拔高度及不同时间节段下大鼠胃电活动变化及其对胃Cajal(interstitial cell of Cajal，ICC)间质细胞微观结构和功能的影响。方法130只SD雄性大鼠随机分为低海拔地区组(西安，海拔400 m)，中度海拔地区(西宁，海拔2 260 m)和高海拔地区(玛多，海拔4 300 m)，中度和高度海拔组又以急进高原的时间分为1 d，3 d，5 d，7 d，10 d和14 d组，每组10只大鼠。测定各组大鼠胃电活动数据，并应用免疫荧光染色及电子显微镜观察胃电起搏区ICC的功能及微观结构变化。结果大鼠胃电的波幅及波频在中度海拔地区5 d组及高海拔地区3 d组下行到最低点(P<0.05)，且高海拔地区3 d组受损更加明显(P<0.05)。大鼠胃电起搏区ICC的功能及微观结构也可同步观察到类似改变，于中度海拔地区5 d组及高海拔地区3 d组受损最明显，电镜下可观察到ICC的缝隙连接减少、细胞器减少并出现凋亡小体等，并以高海拔地区3 d组最显著。用c-kit免疫荧光标记同部位ICC，也可观察到中度海拔地区5 d组及高海拔地区3 d组免疫荧光强度最低(P<0.05)，且高海拔地区3 d组降低更显著(P<0.05)。结论急进高原对于大鼠胃电活动影响显著，且海拔高度越高，大鼠胃电活动受损越严重，下行的速度越快，越早到达最低点。大鼠胃电起搏区的ICC微观结构及功能也出现相应同步损害，表明，ICC可能在急进高原胃动力紊乱形成机制中广泛参与并发挥重要作用。

关键词：高原病；高海拔；胃动力；Cajal间质细胞；大鼠

近年来随着经济发展及交通条件的大幅改善，尤其是青藏铁路的开通，每年因旅游、科研、朝圣及工作需要等原因进入青藏高原活动的人数多达数百万[1]，而高原独有的气压低、含氧低、气温低、紫外线强等自然环境会对机体造成很多影响，从而引发呼吸、循环、神经、消化等多系统损伤，产生功能紊乱[2]。其中，急进高原胃肠动力紊乱是高原胃肠应激反应的主要表现之一，以腹胀、恶心、呕吐、腹泻、食欲减退等消化道症状最为突出，这些症状一般经7-10 d的高原适应后逐渐减轻或消失[3]。

目前有关于高原胃肠动力紊乱的研究多集中在临床及部分基础研究上，以应用B超、X线钡餐、激素测定、内镜等检查手段观测高原应激时的胃肠动力变化为主，而详细探讨高原胃肠动力紊乱变化规律，以及其形成机制的细胞分子生物学领域的研究则少见报道[4]。另外，既往的研究表明ICC具有产生、传播慢波的功能，并以胃电发生起搏细胞的角色，在胃肠道动力的产生及调控中发挥关键作用[5-7]。那么急进高原后大鼠胃运动发生紊乱时，其胃电活动是如何发生变化的，胃电起搏区ICC的微观结构及功能是否也存在相应改变，它们之间有何关联变化，将是我们研究的重点。本实验将测定急进高原不同海拔不同时间节点下大鼠胃电活动变化情况，并同时使用电子显微镜及免疫荧光标记的方式，观察急进高原对大鼠胃电起搏区ICC微观结构及功能的影响，为进一步探讨急进高原胃肠动力紊乱的发生机制提供理论依据。

1材料与方法

1.1主要仪器及试剂

RM6280B生物信号采集处理系统(成都仪器厂生产)，超低温冰箱(-80 ℃)及超低温切片机(美国NUAIR公司)，FV1000激光共聚焦显微镜(日本OLYMPUS公司)，TecnaiG2分析透射电镜(美国FEI公司)，兔抗大鼠多克隆c-kit抗体(LifeSpan BioSciences公司)，羊抗兔IgG alexa fluor 594单克隆抗体(美国Jackson公司)。

1.2实验动物与分组

SD雄性大鼠130只，SPF级，许可证号：SCXK(陕)2012-003，体重(200±20)g，全部购自西安交通大学实验动物中心，所有实验大鼠随机分为3大组13小组。即以实验地区海拔高度划分3大组，A组低海拔地区组(西安，海拔400 m)、B组中度海拔地区组(西宁，海拔2 260 m)、C组高海拔地区组(玛多，海拔4 300 m)。另以大鼠起运后3 d内进驻实验现场模拟急进高原状态，并以进驻后的时间节点为依据，依达到实验地区后的时间顺序于B、C两组下设6个亚组，即：1 d,3 d,5 d,7 d,10 d,14 d组，每组10只大鼠。

1.3胃电生理活动检测

SD大鼠术前12 h禁食，术前6 h禁水，戊巴比妥钠腹腔注射(40 mg/kg)麻醉，通过大鼠腹部正中切开，选择胃电起搏区的胃体中部上1/3处浆膜层埋置引导电极[8]，测量胃电活动变化，参数设定为“生物电，500 mV，直流，30 Hz”，记录波形并分析。

1.4实验标本的采集与固定

电生理测定完成后处死大鼠，剪开胸腔，经升主动脉插管，快速灌入生理盐水冲去血液，并沿胃大弯测剪开，于胃体中部上1/3处取0.2 cm×0.1 cm大小组织，放入3%戊二醛固定用于电镜染色，后继续经升主动脉先快后慢灌注冷的(4 ℃)4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液(PB，pH7.4)500 ml，注毕立即取全胃置于20%的蔗糖溶液中过夜沉底。

1.5电镜观察胃电起搏区ICC细胞微观结构变化

取3%戊二醛固定后组织用0.2 mol/L蔗糖磷酸缓冲液漂洗，再用2%的四氧化锇后固定1 h，丙酮中梯度脱水，在1%醋酸双氧铀中停滞染色1 h，再通过环氧丙烷与环氧树脂。1 mm切片用亚甲蓝染色，在光镜下观察，确定黏膜层、环形肌层、纵行肌层，再次经70 nm超薄切片后用酒精醋酸双氧铀、再用柠檬酸盐后染色，保留纵行肌层、环形肌层、黏膜下层、部分黏膜层，用透射电镜观察、照相。

1.6免疫荧光化学法标记ICC后图像分析

取固定后胃体中部上1/3处0.4 cm×0.2 cm组织用超低温切片机切片10 μm，使用0.01 mol/L PBS反复漂洗3次后，置入含0.3% Triton X-100的0.01 mol/L PBS中浸泡30 min(室温)，再经0.01 mol/L PBS液漂洗后进行免疫组织化学荧光染色(以c-kit抗体标记ICC细胞)：加入兔抗大鼠多克隆c-kit抗体(1∶150)孵育24 h(室温)，经0.01 mol/L PBS液漂洗3次后，所有切片均加入羊抗兔IgG alexa fluor 594单克隆抗体(1∶300)，避光孵育2 h(室温)。经0.01 mol/L PBS洗3次后，80%甘油封片，以上过程均需避光操作。各组切片各取10张，在FV1000激光共聚焦显微镜下采用20倍及40倍视野观察，观察每一张切片取6-8个视野，并将数字化图像储存。

1.7统计学分析

2结果

2.1急进高原后大鼠在中度海拔及高海拔地区各时间段下的电生理变化

急进高原后随着海拔高度的升高，胃电的波频及波幅受损明显，且海拔高度越高，受损下行越快，越早到达最低点(见表1，2，图1)。在中度海拔地区胃电波频变化不明显，仅在5 d组出现统计学差异(P<0.05)，而波幅相对变化显著，1 d组即可观察到明显变化(P<0.05)，至5 d组下降到最低点(P<0.05)。而高海拔地区则可以观察到明显波频、波幅变化，并均于3 d组达到最低点(P<0.05)，且高海拔地区大鼠胃电活动受损情况较中度海拔地区最低点时显著下降，高海拔1 d组与中度海拔1 d组比较，高海拔3 d组与中度海拔5 d组比较差异均有统计学意义。另外通过实验观察可见，海拔高度对于波频的影响相对较低，较易恢复，中度海拔地区在7 d组，高海拔地区在5 d组即基本恢复正常，与低海拔组相比无统计学差异(P>0.05)，而波幅恢复相对较慢，且所处海拔高度越高恢复越慢。

组别1d3d5d7d10d14d低海拔组1839.31±611.46 中度海拔组 581.96±207.22*259.77±28.71 222.08±55.04#264.68±38.73430.77±147.64670.12±169.74高海拔组 265.30±39.52*△173.98±26.29▲★214.25±44.01333.31±81.87391.83±78.84507.67±108.25

与低海拔组比较，*P<0.05；与中度海拔1 d组比较，△P<0.05；与中度海拔5 d组比较，▲P<0.05; 中度海拔组与3 d及7 d组比较，#P<0.05；高海拔组与1 d及5 d组比较，★P<0.05

组别1d3d5d7d10d14d低海拔组49.67±0.96中度海拔组49.56±0.7748.72±1.6748.54±2.11*49.45±0.8649.8±0.3249.84±0.44高海拔组 48.42±1.48*△ 44.63±0.87#▲49.21±1.02 49.4±1.2549.71±0.6 49.88±0.33

与低海拔组比较，*P<0.05；与中度海拔1 d组比较，△P<0.05；与中度海拔5 d组比较，▲P<0.05；高海拔组与1 d及5 d组比较，#P<0.05

A为低海拔组； B1-B6分别为中度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d组； C1-C6分别为高度度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d组 图1　大鼠快速进入高海拔地区后胃电活动时程变化Figure 1　Effects of ascending to high altitude on gastric electrical activity in the rats

2.2急进高原后大鼠在中度海拔及高海拔地区各时间段下胃电起搏区的ICC的微观结构变化

低海拔地区对照组ICC在电镜下观察可见：细胞结构完整，缝隙连接紧密，核周细胞质充盈，细胞器数量较多，细胞内部罕见空泡样改变，无凋亡小体。急进高原地区后，细胞微观结构受外界环境影响、受损，尤其在中度海拔地区5 d组及高海拔地区3 d组表现最为明显。ICC细胞缝隙连接变得松散、减少；核周细胞质空泡样改变加重，甚至部分ICC基膜不完整形成空洞；细胞内细胞器数量明显减少，细胞线粒体可见空泡样肿胀，部分可见内质网轻度扩张；部分形成核固缩，核内可见异染色质，凋亡小体明显增多；更严重的可见尚存细胞的连接结构明显破坏，连接松散，核周胞质显著减少，线粒体肿胀变性，空洞随处可见，核内可见大量凋亡小体及异染色质(见图2)。

2.3急进高原后大鼠在中度海拔及高海拔地区各时间段下胃电起搏区的c-kit表达的变化

实验结果表明，不论是中度海拔地区还是高海拔地区，与低海拔地区对照组相比，大鼠胃电起搏区c-kit表达明显下降，1 d组即出现明显变化(P<0.05)，且进入地区的海拔高度越高下降幅度越快，中度海拔地区于5 d组到达最低点(P<0.05)，高海拔地区于3 d组下行到最低点(P<0.05)，而后缓慢恢复。且海拔越高影响越严重，高海拔地区3 d组与中度海拔地区5 d组比较c-kit表达强度明显减弱(P<0.05，见表3，图3)。

A1,A2为低海拔组； B1-B6分别为中度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d组； C1-C6分别为高度度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d组图2　大鼠快速进入高海拔地区后对胃电起搏区ICC细胞微观结构的影响Figure 2　Effects of ascending to high altitude on ultrastructure of ICC in the gastric pacing location

组别1d3d5d7d10d14d低海拔组45.85±1.78中度海拔组37.36±1.72*35.88±1.67 33.4±1.71#35.32±1.5936.14±1.7937.29±2.46高海拔组33.27±2.05*△30.77±1.98▲★31.87±1.9333.1±2.1833.57±1.7935.95±2.01

与低海拔组比较，*P<0.05；与中度海拔1 d组比较，△P<0.05；与中度海拔5 d组比较，▲P<0.05;中度海拔组与3 d组及7 d组比较，#P<0.05; 高海拔组与1 d组及5 d组比较，★P<0.05

A，Aa为低海拔组； B1-B6分别为中度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d组； C1-C6分别为高度度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d组图3　大鼠快速进入高海拔地区后对胃电起搏区c-kit表达变化Figure 3　Expression of c-kit in ICCs in rats gastric pacing location after ascending to high altitude

3讨论

初入高原者易引发机体低张性缺氧，为了保障心、脑等重要脏器的供养，机体需调整体内血液分布进而收缩皮肤及胃肠道血管，造成一系列消化道症状。高原胃肠应激反应是急性高原病的常见表现，消化系统功能障碍甚至能够进一步加重其他原发高原疾病的病情，造成严重后果[9]。目前在高原胃肠动力紊乱的研究领域，有关胃肠电节律规律性变化的研究、报道尚不多，尤其是详细描述整个受损、恢复过程的报道尚罕见。目前已知的研究表明ICC作为慢波的起源细胞可与肠神经系统(enteric nervous system，ENS)及消化道平滑肌(smooth muscle cell，SMC)形成网络状连接，并组成胃肠动力的基本功能单位(basically functional unit GI motility，BFUGM)[10]，它同时与抑制性和兴奋性神经纤维形成紧密联接，在ENS和SMC之间的进行信息传递[4]，进而影响胃肠的基本电节律造，并以此来调控胃肠运动[11-14]。近年来大量的研究表明[15-17]，诸多胃肠动力障碍疾病的患者存在ICC功能的损伤，如：糖尿病胃轻瘫、慢性便秘、功能性消化不良等，其主要表现在ICC数量的减少、缺失及ICC网络的受损及神经递质分泌异常等，并最终导致慢波的异常，进而引起胃肠动力疾病或障碍。可以看出在胃肠动力障碍疾病的研究领域中，ICC细胞的地位不容忽视，十分重要。

通过观察急进高原后大鼠胃电活动的变化规律可以发现，海拔高度对大鼠胃电活动影响明显，进入地区的海拔高度越高，受损越严重，胃电活动下行的速度越快，尤以波幅为著。在中度海拔地区1 d组大鼠胃电波幅下降显著而波频下降不明显，于5 d组胃电波幅降至最低谷时胃电波频才显著下降，此后胃电波频快速恢复，而波幅则恢复相对缓慢。高海拔地区测量结果与之类似，但大鼠胃电活动受损更为明显，不论波频还是波幅均在1 d组即可观察到显著下降，并于3 d组到达最低点，且其下行幅度与中度海拔地区5 d组相比受损更加严重，同样是波频先恢复，而波幅恢复速度较西宁地区更加缓慢。此外，使用电子显微镜观察各组大鼠胃电起搏区ICC细胞微观结构的变化，并结合ICC表达量的变化进行分析，可以发现类似的损伤变化规律，即急进高原大鼠胃电活动受损发生下行变化时，ICC的微观结构及表达量也同步发生损伤变化，海拔高度越高，ICC微观结构受损越严重，代表ICC表达量的免疫荧光强度值越低，并同样于中度海拔5 d组、高海拔3 d组下行到最低点，且后者下降幅度更大，恢复更慢。可见大鼠进入高海拔地区后，其胃电活动变化与胃电起搏区ICC微观结构及功能变化存在明显的关联性，因此我们分析急速进入高海拔地区后，在胃动力紊乱的发生机制中，ICC细胞可能广泛参与其中并发挥重要作用，这将为我们以后进一步探讨急进高原胃肠动力紊乱的发生机制提供基础理论依据。

参考文献：

[1]Wu TY,Ding SQ,Liu JL,etal.Who should not go high:chronic disease and work at altitude during construction of the Qinghai-Tibet railroad[J].High Alt Med Biol,2007,8(2):88-107.

[2]Debudaj A,Bobiński R.The pathophysiology of acute mountain sickness(Article in Polish)[J].Pol Merkur Lekarski,2010,28(168):478-481.

[3]高钰琪.高原军事医学[M].重庆：重庆出版社，2005：106-110.

[4]朱琳，贺巍，杨生岳，等.Cajal间质细胞在急进高原胃肠动力紊乱中的作用的展望[J].现代生物医学进展，2013，13(34):6786-6790.

[5]Rich A,Hanani M,Ermilov LG,etal.Physiological study of interstitial cells of Cajal identified by vital staining[J].Neurogastroenterol Motil,2002,14(2):189-196.

[6]Daniel EE,Thomas J,Ramnarain M,etal.Do gap junctions coupleinterstitial cells of Cajal pacing and neurotransmission to gastrointestinal smooth muscle?[J].Neurogastroenterol Motil,2001,13(4):297-307.

[7]Huizinga JD.Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal:from bench to bedside.Ⅱ.Gastric motility:lessons from mutant mice on slow waves and innervation[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2001,281(5):G1129-1134.

[8]黄裕新，王伟，夏德雨，等.白萝卜提取物促胃动力作用中Cajal间质细胞与P物质的变化[J].胃肠病学和肝病学杂志，2008，17(6):467-469.

[9]武金宝，王继德，张亚历.肠黏膜屏障研究进展[J].世界华人消化杂志，2003，11(5):619-623.

[10]Wang XY,Vannucchi MG,Nieuwmeyer F,etal.Changes in interstitial cells of Cajal at the deep muscular plexus are associated with loss of distention-induced burst-type muscle activity in mice infected by Trichinella spiralis[J].Am J Pathol,2005,167(2):437-453.

[11]Bielefeldt K,Conklin JL.Intestinal motility during hypoxia and reoxygenation in vitro[J].Dig Dis Sci,1997,42(5):878-884.

[12]Huizinga JD,Thuneberg L,etal.Interstitial cells of cajal as targets for pharmacological intervention in gastrointestinal motor disorders[J].Trends Pharmacol Sci,1997,18(10):393-403.

[13]孙金山，王宝西.Cajal间质细胞与胃肠动力疾病[J].中国当代儿科杂志，2006，8(2):164-168.

[14]Wu MJ,Kee KH,Na J,etal.Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide inhibits pacemaker activity of colonic interstitial cells of Cajal[J].Korean J Physiol Pharmacol,2015,19(5):435-440.

[15]Knowles CH,Farrugia G.Gastrointestinal neuromuscular pathology in chronic constipation[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol,2011,25(1):43-57.

[16]Yamamoto T,Watabe K,Nakahara M,etal.Disturbed gastrointestinal motility and decreased interstitial cells of Cajal in diabetic db/db mice[J].J Gastroenterol Hepatol,2008,23(4):660-667.

[17]Zhang H,Xu X,Wang Z,etal.Correlation between gastric myoelectrical activity recorded by multi-channel electrogastrography and gastric emptying in patients with functional dyspepsia[J].Scand J Gastroenterol,2006,41(7):797-804.

Effects of ascending to high altitude on gastric motility, ultrastructure and function of interstitial cell of Cajal in the rats

ZHU Lin, HE Wei*, YANG Shengyue, FAN Xingai, LIU Ruinian, CHEN Lei

(DepartmentofGastroenterology,FourthHospitalofPLA,Xining810007,China;*Correspondingauthor,E-mail:hewei.1971@163.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the influence of different altitude and duration time on the gastric electrical activities, the ultrastructure and physiological function of ICCs in high altitude-exposed rats.MethodsA total of 130 SD male rats were divided into three groups: low(Xi’an, 400 m), moderate(Xining, 2 260 m) and high altitude(Maduo, 4 300 m) groups. On the basis of duration time after entering the plateau, the moderate and high altitude groups were further divided into six subgroups(n=10 in each group): 1 d, 3 d, 5 d, 7 d, 10 d, and 14 d groups. The gastric electrical activity was recorded in different groups. Immunofluorescence staining and electron microscope were applied to observe the physiological function and ultrastructure of ICC cells in gastric electrical pacing region.ResultsThe amplitude and frequency of gastric electrical activity were the lowest in moderate altitude 5 d group and high altitude 3 d group(P<0.05). The damage in high altitude 3 d group was the most severe(P<0.05). The physiological function and ultrastructure of ICC cells showed the similar changes in gastric electrical pacing region. The gap junctions and organelles of ICC cells were reduced in moderate altitude 5 d group and high altitude 3 d group, and apoptotic bodies were observed under electron microscope, especially in high altitude 3 d group(P<0.05). The c-kit immunofluorescence results showed the same tend of changes.ConclusionThe gastric electrical activity in rats is significantly influenced by high altitude exposure, and the injury is more serious in higher altitude. The ultrastructure and function of ICCs in gastric pacing location are impaired in the same tendency. The results indicate that the ICCs may play an important role in gastric dynamic disorders in high altitude-exposed rats.

Key words:mountain sickness；high altitude；gastric motility；interstitial cell of Cajal；rats

基金项目：青海省(应用)基础研究基金资助项目(2013-Z-760)

作者简介：朱琳，男，1979-11生，硕士，主治医师，E-mail:298567115@qq.com

收稿日期：2016-03-22

中图分类号：R361

文献标志码：A

文章编号：1007-6611(2016)06-0505-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.06.005